Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.
Artykuł metodologiczny
Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecne technologie obrazowania nowotworów, takie jak USG, MRI, PET i CT, nie są w stanie dostarczyć obrazów o wysokiej rozdzielczości niezbędnych do oceny wychwytu nanocząsteczek w guzach na poziomie mikroskopowym1,2,3, co podkreśla użyteczność odpowiedniego modelu ksenoprzeszczepu do przeprowadzania szczegółowych analiz wychwytu. W niniejszej pracy wykorzystujemy obrazowanie intravitalne o wysokiej rozdzielczości do oceny wychwytu nanocząsteczek w ludzkich ksenoprzeszczepach nowotworowych w zmodyfikowanym modelu zarodka kurczaka bez skorupki. Model zarodka kurczaka jest szczególnie odpowiedni do tych analiz in vivo , ponieważ wspiera wzrost ludzkich nowotworów, jest stosunkowo tani i nie wymaga znieczulenia ani operacji 4,5. Komórki nowotworowe tworzą w pełni unaczynione ksenoprzeszczepy w ciągu 7 dni po implantacji w błonę chorioallantoiczną (CAM) 6. Powstałe guzy są wizualizowane za pomocą nieinwazyjnego obrazowania w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości, które może być kontynuowane przez maksymalnie 72 godziny przy niewielkim wpływie na systemy gospodarza lub nowotworu. Nanocząsteczki o szerokim zakresie rozmiarów i formulacji, podane w miejscu oddalonym od guza, mogą być wizualizowane i ilościowo określane podczas przepływu przez krwiobieg, ekstrawazacji z nieszczelnego unaczynienia guza i akumulacji w miejscu nowotworu. Opisujemy tutaj analizę nanocząsteczek pochodzących z wirusa mozaiki fasoli (CPMV) znakowanych bliskopodczerwonymi barwnikami fluorescencyjnymi i/lub polimerami glikolu polietylenowego (PEG) 7, 8, 9,10,11. Po podaniu dożylnym te wirusowe nanocząsteczki są szybko internalizowane przez komórki śródbłonka, co skutkuje globalnym znakowaniem naczyń krwionośnych zarówno poza guzem, jak i w jego obrębie7,12. PEGylacja wirusowych nanocząsteczek zwiększa ich okres półtrwania w osoczu, wydłuża czas ich krążenia, a w konsekwencji wzmacnia ich akumulację w nowotworach poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) 7, 10,11. Szybkość i stopień akumulacji nanocząsteczek w guzie są mierzone w czasie przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Technika ta zapewnia metodę zarówno wizualizacji, jak i ilościowego określania dynamiki nanocząsteczek w ludzkich nowotworach.
Protokół
1. Inokulacja guza do błony prawidłowej (CAM) zarodka ptaka
- Przygotować zapłodnione embriony kurcząt pozbawione skorup zgodnie z opisem8.
- W 9. dniu rozwoju embrionalnego złożyć mikroinżektor, używając igły o rozmiarze 18G podłączonej do strzykawki 1 mL. Odciąć kawałek rurki Tygon o długości 5-6 cali (średnica wewnętrzna 1/32", średnica zewnętrzna 3/32", grubość ścianki 1/32") i ostrożnie wsunąć ścięty koniec igły do rurki. Z końcówki igły powinno wystawać około 4-5 cali rurki (Rycina 1a).
- Napełnić strzykawkę i rurkę zawiesiną komórkową. Następnie wstawić szklaną igłę do mikroiniekcji na końcu rurki i ostrożnie usunąć pęcherzyki powietrza.
- Wstrzyknąć do embrionów w 9. dniu rozwoju (Rycina 1b) pod stereomikroskopem z oświetlaczem od 10 000 do 100 000 komórek nowotworowych w formie bolusa do błony CAM (Rycina 1c). Wstrzykiwać komórki powoli, upewniając się, że igła znajduje się w odpowiednim miejscu, aby komórki utworzyły widoczny bolus wewnątrz błony CAM. Komórki, które skapią na powierzchnię błony CAM, można usunąć za pomocą chusteczki Kimwipe lub innego aplikatora.
- Przenieść embriony z powrotem do inkubatora z nawilżaczem w temperaturze 38°C i wilgotności 60%, pozwalając na wzrost i unaczynienie guza (do 7 dni).
2. Przygotowanie nanocząsteczek
- Aby przygotować nanocząsteczki CPMV znakowane fluorescencyjnie do wstrzyknięcia do zarodka kurczaka, należy rozcieńczyć nanocząsteczki wirusowe (syntetyzowane zgodnie z metodą 8) w PBS, pH 7.4, do stężenia 100 μg/ml. Przed użyciem mieszaninę należy dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex i odwirować przez jedną minutę w celu usunięcia ewentualnych agregatów. W zależności od koniugatów i stopnia agregacji pomocne może być również sonikowanie. Zapasy fluorescencyjnie znakowanych CPMV są stabilne przez co najmniej 1 rok przy przechowywaniu w temperaturze 4°C w ciemności. Stan zapasów należy okresowo sprawdzać, nakładając kilka kropli na szkiełko przedmiotowe i weryfikując obecność fluorescencji. Do określenia, czy cząsteczki pozostały nienaruszone po koniugacji, można również zastosować transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM).
- Krótko mówiąc, jeden mikrogram nanocząsteczek wirusowych (w końcowej objętości 2 μl) można nanieść na siatki pokryte miedzią. Następnie należy dodać taką samą objętość 2% octanu uranylu na 1 minutę przed obserwacją w mikroskopie elektronowym (Philips EM 410).
3. Dożylne wstrzyknięcie nanocząstek wirusowych znakowanych fluorescencyjnie
- W 16. dniu złożyć mikroinżektor zgodnie z powyższym opisem. Nabrać pożądaną objętość nanocząsteczek wirusowych przez rurkę do strzykawki (> 200 μL). Ostrożnie usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Wprowadzić szklaną igłę do mikroiniekcji na koniec rurki. Upewnić się, że igła jest jak najdłuższa i jak najbardziej zwężająca się (Rycina 2a). Jeśli igła będzie zbyt tępa, nie przebije się przez ektodermę i nie przeniknie do naczynia. Jeśli igła będzie zbyt ostra, końcówka ulegnie zmiażdżeniu podczas penetracji tkanki.
- Wstrzyknąć dożylnie 100 μl roztworu dekstranu fluoresceinowego o stężeniu 1 mg/ml (MW 70,000 Da, Invitrogen) do zarodka z nowotworem, w miejscu oddalonym od obszaru docelowego do wizualizacji (Rycina 3d). Prawidłowe kaniulowanie żyły błony żółtkowej (CAM) jest widoczne poprzez przejaśnienie krwi na drodze przepływu wstrzykiwanej substancji (Rycina 2b). Ocenić przeciek naczyniowy 1 godzinę po iniekcji.
- Wstrzyknąć dożylnie 50 μl roztworu o stężeniu 1 mg/ml CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) lub pegylowanego CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) do zarodków z nowotworami wykazującymi przeciek naczyniowy, w miejscu oddalonym od obszaru docelowego do wizualizacji.
- Obrazować nowotwory natychmiast oraz co godzinę po iniekcji, używając mikroskopu odwróconego Zeiss Examiner Z1 wyposażonego w dysk wirujący Yokogawa oraz kamerę EM-CCD Hamamatsu ImagEM 9100-12.
4. Obrazowanie intravitalne w czasie rzeczywistym
- Aby złożyć jednostkę do obrazowania zarodków, nanieś cienką warstwę smaru próżniowego wokół obwodu portu obrazowania na spodniej stronie pokrywy jednostki do obrazowania zarodków, a następnie dopasuj szklaną lamellkę o średnicy 18 mm do portu.
- Ustaw zarodek w taki sposób, aby lamellka zakrywała wybrany obszar do obrazowania. Powoli opuszczaj pokrywę, aż lamellka zetknie się z zarodkiem, a następnie przykręć pokrywę do jednostki, aby ją unieruchomić (Rysunek 2c).
- Wlej wodę podgrzaną do 37°C do jednostki do obrazowania zarodków, poza naczynie zawierające zarodek, a następnie umieść całą jednostkę na stole pionowego mikroskopu konfokalnego z wewnętrzną komorą środowiskową ustabilizowaną w temperaturze 37°C.
- Umieść jednostkę do obrazowania zawierającą zarodek pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym z dyskiem obrotowym (Rysunek 2e). Jednostka do obrazowania unieruchomi zarodek i utrzyma stałe pole widzenia podczas przechwytywania obrazów, co umożliwi wykonanie zarówno trójwymiarowych stosów Z, jak i obrazów time-lapse. Obrazy trójwymiarowe time-lapse pozyskujemy i analizujemy za pomocą pakietu oprogramowania Volocity firmy Perkin Elmer (dawniej Improvision) (Rysunek 3a). Pozyskaj wysokorozdzielczy trójwymiarowy stos obrazów guza i otaczających go naczyń krwionośnych, aby przeprowadzić szczegółowe analizy strukturalne w określonych punktach czasowych. Pozyskuj trójwymiarowe stosy w regularnych odstępach czasu, aby mapować szczegółowe zmiany strukturalne w unaczynieniu guza. Obrazuj guzy co godzinę po wstrzyknięciu.
- Ilościowo określ pobór nanocząsteczek wirusowych, obliczając średni sygnał Alexa Fluor (AF) 647 w wybranych obszarach guza lub w zrębie (obszarze pozaguzowym) przy użyciu oprogramowania do kwantyfikacji obrazu, takiego jak Volocity (Perkin Elmer). Stosunek guza do zrębu obliczono, dzieląc średni sygnał AF 647 w guzie przez średni sygnał AF 647 w zrębie. Stosunek guz/zrąb wyższy niż 1 wskazuje na to, że nanocząsteczki są pobierane przez guz.
5. Reprezentatywne wyniki:
W opisanym tutaj przykładzie wstrzyknięto komórki raka jelita grubego HT-29, aby utworzyć kuleczkę o wielkości około 1mm w obrębie błony błony treściowej (CAM) 9-dniowych zarodków kurzych (Rysunek 1b). Po inokulacji zarodki hodowano przez 7 dni w inkubatorze z nawilżaniem, aby umożliwić odpowiedni wzrost i unaczynienie guza (Rysunek 1c). Zarodom wstrzyknięto dożylnie dekstran o niskiej masie cząsteczkowej w celu potwierdzenia unaczynienia guza, a następnie guzy zobrazowano za pomocą mikroskopu odwróconego Zeiss AxioExaminer Z1 (Rysunek 2d).
Po dożylnym podaniu nanocząstek CPMV-AF 647 lub CPMV-PEG-AF 647 (rycina 3a i b), wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne w czasie rzeczywistym (rycina 2e) wykazało, że zarówno nanocząstki CPMV, jak i CPMV-PEG szybko oznakowały całe układ naczyniowy, jednak pobranie CPMV-PEG przez guz było około 3 razy wyższe niż w przypadku CPMV po 12 godzinach (rycina 3a). Względne pobranie nanocząstek przez guz określono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (Volocity firmy Perkin Elmer). Wybrano obszary zainteresowania w obrębie guza oraz poza nim (w przedziale zrębowym), a następnie określono średnią intensywność fluorescencji dla każdego z nich. Dane przedstawiono jako stosunek guza do zrębu.
Rycina 1.Mikrowstrzykiwanie guzów do błony CAM embrionu ptaka. (a) Aparatura do mikrowstrzykiwania składa się z komponentów wskazanych na schemacie. (b) Embriony ptaków w 9. dniu są gotowe do inokulacji guzem, gdy błona CAM rozprzestrzeni się, pokrywając całą powierzchnię. (c) W 16. dniu guz urośnie do średnicy do 1 cm (linia przerywana) i będzie gotowy do wstrzyknięcia nanocząsteczek.
Rysunek 2.Wstrzykiwanie nanocząstek i obrazowanie intravitalne. Wstrzykiwanie pod mikroskopem sekcyjnym przedstawiające (a) końcówkę igły mikroinjektora przygotowaną do wstrzyknięcia do żyły CAM oraz (b) igłę mikroinjektora wprowadzoną do żyły (wskazaną strzałką) i nanocząstki wstrzykiwane do przepływu krwi (widoczne poprzez przejaśnienie krwi). (c) Jednostka obrazująca zawierająca embrion ptaka z szkiełkiem podstawowym stykaćcym się bezpośrednio z CAM. (d) Przed wstrzyknięciem nanocząstek unaczynienie guza jest oceniane za pomocą obrazowania intravitalnego po wstrzyknięciu dekstranu fluoresceiny. (e) Jednostka obrazująca zawierająca embrion umieszczonego na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego w komorze z regulowaną temperaturą ustawioną na 37°C.
Rysunek 3. Wizualizacja intravitalna pobierania nanocząsteczek w ludzkich guzach. Guzy są wizualizowane 7 godzin po wstrzyknięciu (a) CPMV-AF647 oraz (b) CPMV-PEG-AF647. d) Wycięcie guza z zarodka ptaka do dalszej analizy.
Dyskusja
Błona pozarodłowa (CAM) embrionu ptaka jest użytecznym modelem do oceny dynamiki naczyniowej i farmakokinetyki ludzkich guzów. Struktura i położenie CAM umożliwiają wysokiej jakości akwizycję obrazów i pozwalają na implementację wielu rodzajów ksenoprzeszczepów nowotworowych bez konieczności przeprowadzania inwazyjnych procedur chirurgicznych. Ponadto ksenoprzeszczepy nowotworowe zaimplantowane w błonę pozarodłową ulegają unaczynieniu w ciągu 7 dni, oferując szybki, niedrogi i półwysokoprzepustowy sposób oceny akumulacji nanocząsteczek w tkance nowotworowej. Ponieważ ksenoprzeszczepy nowotworowe zaimplantowane w CAM bezskorupkowych zarodków kurzych są dostępne dla optyki o wysokiej rozdzielczości pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, można łatwo uzyskać kontekstowe i czasowe informacje dotyczące poboru nanocząsteczek przez unaczynienie guza. Ksenoprzeszczepy nowotworowe w tym modelu mają tendencję do wzrostu bocznego w obrębie CAM, co skutkuje powstaniem guzów, które są duże, ale ich głębokość pozostaje mniejsza niż 200 µm. Dzięki temu są one szczególnie odpowiednie do obrazowania intravitalnego, ponieważ standardowe mikroskopy epifluorescencyjne mogą efektywnie penetrować całą masę guza. W przeciwieństwie do tego, guzy zaimplantowane w miejscach powierzchownych lub ortotopowych u myszy proliferują trójwymiarowo, co utrudnia dokładną lokalizację nanocząsteczek głęboko wewnątrz tych guzów za pomocą technik nieinwazyjnych. Wykorzystaliśmy ten model do oceny poboru kropek kwantowych, liposomów i nanocząsteczek tlenku żelaza w kilku ludzkich ksenoprzeszczepach nowotworowych, wskazując na potencjał tego modelu do analizy in vivo szerokiej gamy formulacji nanocząsteczek.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badanie to było wspierane przez grant CCSRI nr 700537 oraz grant CIHR nr 84535 dla JDL oraz granty NIH/NCI nr CA120711-01A1 i CA120711-01A1 dla AZ. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z regulacjami i wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee na University of California San Diego oraz Animal Care and Use na University of Western Ontario.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zapłodnione jaja kurcząt rasy leghorn | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | Nie dotyczy | |
| narzędzie rotacyjne Dremel | Dremel | Można użyć dowolnego modelu | |
| tarcze tnące Dremel nr 36 | Dremel | 409 | |
| Inkubator Sportsman | Berry Hill | 1550HA | |
| Inkubator Sportsman | Berry Hill | 1502EA | |
| Etanol | 70% (obj./obj.) | ||
| Łódeczki wagowe polistyrenowe | VWR international | 12577-01 | |
| Kwadratowe szalki Petriego | Simport | 25378-115 | |
| Gumowy pojemnik Rubbermaid z pokrywką | Guillevin | RH3-228-00-BLU | otwory wywiercone w ściankach bocznych |
| Pionowa wyciągarka do pipet | Instrumenty David Kopf | model 720 | Ustawienia: 16,3 (grzałka) i 2,3 (elektrozawór) |
Kapilary szklane borokrzemianowe sodowe | Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (średnica zewnętrzna 1,0 mm; średnica wewnętrzna 0,58 mm; 10 cm) długość) |
| 1X Dulbecco’podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7,4 |
| bufor fosforanowy (D-PBS) (1X), ciecz | |||
| Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwór | Invitrogen | 25300054 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Invitrogen | 12483-020 | Inaktywacja termiczna |
| Komora countingowa (hemocytometr) | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Pęseta precyzyjna | VWR international | 25607-856 | |
| przewód Tygon R-3603 | VWR international | 63009-983 | 50 ft (średnica wewnętrzna 1/32 cala, średnica zewnętrzna 3/32 cala, grubość ścianki 1/32 cala) |
| Igły podskórne do zastrzyków, igły o rozmiarze 18G | BD Biosciences | 305195 | Opakowanie 100 szt. |
| strzykawki 1 ml do iniekcji | BD Biosciences | 309602 | Opakowanie 100 sztuk |
| Oświetlacz do mikroskopu światłowodowego | Amscope | HL250-AY | 150 W |
| chusteczki Kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata nasiona (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Lampy do uprawy wewnątrz pomieszczeń | SunLite, Gardener’zaopatrzenie | ||
| ester metylo-PEO4-NHS | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, ester sukkcynimidylowy PEG, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| kwas karboksylowy Alexa Fluor 647 (ester sukcynimidylowy) | Invitrogen | A20006 | |
| ester succinimidy Oregon Green 488 * izomer 6 * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Fosforan jednowodorowy dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (do buforu fosforanowego) |
| Wodorofosforan potasu jednowodny | P5655 | KH2PO4 (do buforu fosforanowego) | |
| kolumna do chromatografii wykluczania Superose 6 | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄChromatograf KTA Explorer 100 | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| Äzestaw wysokoprzepływowy KTA | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultrawirówka | Beckman Coulter Inc. | ||
| rotor SW 28 Ti | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Wirówka z koszem z wahadłowymi uchwytami |
| rotor 50.2 Ti | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Kąt stały |
| Centryfugowe jednostki filtrujące Amicon Ultra-15 | EMD Millipore | UFC910008 | próg odcięcia 100 kDa |
| Generator gradientu | Bio-Rad | ||
| dekstran, fluoresceina, 70 000 MW, anionowy | Invitrogen | D1823 | |
| Konfokalny mikroskop fluorescencyjny z dyskiem obrotowym | Quorum Technologies | Brak danych | |
| Mikroskop epifluorescencyjny szerokopolowy | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | Nie dotyczy | |
| Kamera EM-CCD Hamamatsu ImagEM 9100-12 | Quorum; Hamamatsu | Nie dotyczy | |
| Komora temperaturowa do mikroskopu | Tworzywa precyzyjne | Nie dotyczy | |
| Smar próżniowy | VWR international | 59344-055 | |
| Okrągłe szkiełka nakrywkowe nr 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| oprogramowanie Volocity | PerkinElmer, Inc. | ||
| Obudowa zarodka kurczaka | wykonany na zamówienie | ||
| Nożyczki precyzyjne | VWR international | 25608-203 | |
| Formalina | BioShop Canada | FOR201.500 | Stosować w dygestorium |
| Optymalne cięcie | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperatura (OCT) | |||
| Formy plastikowe | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| szkiełka przylepne VWR VistaVision HistoBond | VWR International | 16004-406 | |
| Barwienie Prolong Gold z użyciem DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Jednorazowe noże do kriostatu | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Kriostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
Bibliografia
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
- Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
- Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
- Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
- Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
- Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
- Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , Forthcoming (2010).
Przedruki i uprawnienia
