Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Streszczenie

Czynniki transkrypcyjne w komórkowych sieciach genowych kontrolują wzorce czasoprzestrzenne oraz poziomy ekspresji swoich genów docelowych poprzez wiązanie się z elementami regulacyjnymi cis (CREs), które są krótkimi (˜300-600 bp) odcinkami genomowego DNA znajdującymi się powyżej (upstream), poniżej (downstream) lub w obrębie intronów kontrolowanych przez nie genów. CREs (t.j. enhancery/promotory) zazwyczaj składają się z wielu zgrupowanych miejsc wiązania zarówno dla aktywatorów, jak i represorów transkrypcji^1-3. Służą one jako logiczne integratory sygnałów transkrypcyjnych, generując jednolity wynik w postaci czasoprzestrzennie precyzyjnej i ilościowo dokładnej aktywności promotora. Większość dotychczasowych badań nad regulacją cis u ssaków opierała się na transgenezie u myszy jako metodzie oceny funkcji enhancera CREs^4-5. Technika ta jest czasochłonna, kosztowna i ze względu na efekty miejsca insercji w dużej mierze nieilościowa. Z drugiej strony, ilościowe testy funkcji CRE u ssaków opracowano w systemach hodowli tkankowych (np. testy podwójnej lucyferazy), jednak znaczenie tych wyników in vivo jest często niepewne.

Elektroporacja stanowi doskonałą alternatywę dla tradycyjnej transgenezy u myszy, ponieważ umożliwia zarówno spatiotemporalną, jak i ilościową ocenę aktywności regulacyjnej cis w żywej tkance ssaków. Technika ta okazała się szczególnie użyteczna w analizie regulacji cis w ośrodkowym układzie nerwowym, zwłaszcza w korze mózgu i siatkówce^6-8. Choć elektroporacja siatkówki myszy, zarówno in vivo, jak i ex vivo, została opracowana i szczegółowo opisana przez Matsudę i Cepko^6-7,9, niedawno opracowaliśmy prostą metodę ilościowego pomiaru aktywności specyficznych dla fotoreceptorów elementów CRE w elektroporowanych siatkówkach myszy¹⁰. Biorąc pod uwagę, że ilość DNA wprowadzanego do siatkówki drogą elektroporacji może różnić się w zależności od eksperymentu, w każdym badaniu konieczne jest zastosowanie współelektroporowanej „kontroli załadunku”. Pod tym względem technika ta jest bardzo podobna do podwójnego testu lucyferazowego stosowanego do ilościowego pomiaru aktywności promotora w hodowlach komórkowych.

Podczas badania aktywności cis-regulatorowej fotoreceptorów elektroporację zazwyczaj przeprowadza się u noworodków myszy (0. dzień postnatalny, P0), co odpowiada okresowi szczytowej produkcji pręcików^11-12. Gdy typy komórek siatkówki stają się postmitotyczne, elektroporacja jest znacznie mniej wydajna. Biorąc pod uwagę wysoką stopę powstawania pręcików u noworodków myszy oraz fakt, że pręciki stanowią ponad 70% komórek w siatkówce dorosłej myszy, większość komórek poddanych elektroporacji w dniu P0 to pręciki. Z tego powodu fotoreceptory pręcikowe są najłatwiejszym do badania typem komórek siatkówki za pomocą elektroporacji. Technika opisana w niniejszym materiale jest przede wszystkim użyteczna do ilościowego określania aktywności elementów CRE fotoreceptorów.

Protokół

1. Konstrukcja komory do elektroporacji

1. Zamów mikroslajd, BTX Model 453 z przerwą 3,2mm (Harvard Apparatus #45-0105) (Rys. 2A). Metalowe szyny powinny być całkowicie uszczelnione u podstawy slajdu.
2. Użyj narzędzia Dremel, aby odciąć uchwyt z plastikowego statywu do probówek do mikrocentryfugi. Potnij uchwyt na 5 małych prostokątnych kawałków o następujących wymiarach: długość 0,8cm, wysokość 0,6cm, szerokość 0,3cm (Rys. 2B). Te plastikowe elementy są wielorazowymi odstępnikami, które posłużą do formowania poszczególnych studzienek w komorze mikroslajdu.
3. Wstaw plastikowe odstępniki pomiędzy metalowe szyny mikroslajdu w równych odstępach. Odstępniki powinny przylegać ściśle (Rys. 2C).
4. Odetnij końcówkę z tipa do pipety P200, dopasuj ją do strzykawki 3ml i napełnij strzykawkę w 100% silikonowym uszczelniaczem akwariowym. Wypełnij szczeliny między plastikowymi odstępnikami uszczelniaczem. Należy wypełniać szczeliny od dołu, aby nie powstały pęcherzyki powietrza między korkiem z uszczelniacza a podstawą mikroslajdu.
5. Umieść metalowy pręt na plastikowych odstępnikach i przymocuj go żabkami biurowymi, aby odstępniki pozostały na miejscu podczas wysychania uszczelniacza (Rys. 2D-E). Pozostaw uszczelniacz do wyschnięcia na noc.
6. Usuń żabki biurowe, metalowy pręt oraz plastikowe odstępniki (Rys. 2F). Za pomocą ostrza skalpela usuń resztki uszczelniacza z górnej części metalowych szyn. Użyj mikroskopu sekcyjnego, aby zbadać mikroslajd i upewnić się, że u podstawy silikonowych przegród nie ma pęcherzyków powietrza. Usuń wszelkie błony z uszczelniacza, które mogły powstać w studzienkach, tak aby w ich wnętrzu odsłonić goły metal. Napełnij jedną studzienkę wodą i upewnij się, że woda nie wycieka do sąsiednich studzienek. Powtórz czynność dla wszystkich studzienek.
7. Gotowy mikroslajd pasuje do plastikowej szalki z metalowymi słupkami znajdującymi się obok okienka w bocznej ściance szalki (Rys. 2G); elektrody zostaną w dalszej kolejności przymocowane do metalowych słupków.

2. Przygotowanie DNA

1. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5mL umieszczonej w lodzie należy dodać plazmidowe DNA i uzupełnić objętość do 150μl wodą destylowaną. W celu koelektroporacji można połączyć kilka rodzajów plazmidów (np. eksperymentalny konstrukt DsRed i kontrolny konstrukt GFP). Obliczając ilość DNA do dodania do probówki, należy pamiętać, że końcowa objętość alikwotu DNA wyniesie 60μl. Zazwyczaj każdy konstrukt jest stosowany w końcowym stężeniu 0.5μg/μl.
2. DNA należy wytrącić, dodając 15μl 3M octanu sodu (pH 5.2) oraz 450μl 100% etanolu. Probówkę należy kilkukrotnie odwrócić lub opukać w celu wymieszania zawartości.
3. DNA należy wirować w temperaturze 4°C przy 13 200 rpm przez 30 minut. Osad należy przemyć 70% etanolem, a następnie ponownie wirować w 4°C przy 13 200 rpm przez 15 minut. Osad należy suszyć na powietrzu do momentu, aż stanie się półprzezroczysty (około 7 minut), a następnie resuspender w 54μl sterylnej wody. Należy dodać 6μl sterylnego 10X PBS (pH 7.4) i wymieszać.

3. Pobieranie oczu

1. Sterylizujemy komorę do elektroporacji oraz wszystkie instrumenty 70% etanolem. Choć pobieranie i sekcja oczu nie muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy zdezynfekować rękawiczki oraz blat etanolem i starać się zachować warunki sterylne przez cały czas trwania procedury.
2. Przygotowujemy szalki Petriego z podłożem do sekcji (stosunek 1:1 DMEM:F12, 100U/ml penicyliny, 100μg/ml streptomycyny, 0,29mg/ml L-glutaminy oraz 5μg/ml insuliny): dwie szalki 35mm, każda z 3ml podłoża, oraz jedną szalkę 60mm z 6ml podłoża. Ten krok należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
3. Dezynfekujemy głowę i szyję noworodka myszy (dzień postnatalny 0) 70% etanolem. Szybko dokonujemy dekapitacji za pomocą nożyczek i przenosimy głowę do sterylnej szalki 100mm.
4. Odcinamy skórę głowy małymi nożyczkami, aby odsłonić oczy. Za pomocą zakrzywionej pincety delikatnie wyjmujemy oko z oczodołu i umieszczamy je w szalce 35mm zawierającej podłoże do sekcji. Pomocne może być usuwanie oczu pod mikroskopem sekcyjnym przy małym powiększeniu.
5. Powtarzamy kroki 3.3 i 3.4, aż do momentu zebrania wszystkich oczu. Podczas sekcji oczy przechowujemy w podłożu do sekcji w temperaturze pokojowej. Na każdą alikwot DNA będziemy potrzebować 3-4 oczu.

4. Disekcja siatkówki

1. Użyć 70% etanolu do dezynfekcji żyletki oraz opakowania sterylnej plastikowej pipety transferowej. Odciąć końcówkę pipety żyletką w taki sposób, aby można było zassać całe oko. Przechowywać pipetę w plastikowym opakowaniu, gdy nie jest używana.
2. Przenieść jedno oko z szalki 35 mm do szalki 60 mm. Pod mikroskopem stereoskopowym przy dużym powiększeniu, za pomocą precyzyjnej pęsety, usunąć z powierzchni oka wszelkie tkanki, takie jak mięśnie pozagałkowe i tłuszcz. Następnie usunąć nerw wzrokowy, odcinając go poprzez ściśnięcie u podstawy.
3. W celu wyizolowania siatkówki, wykonać niewielki otwór w twardówce na wysokości limbusa. Wprowadzić jedno ramię każdej z dwóch pęset do otworu ( stycznie do powierzchni siatkówki) i delikatnie rozdarć twardówkę/RPE. U myszy albinosów twardówka i RPE wydają się błyszczące w porównaniu do tkanki siatkówki, która ma jednolity, matowo-szary kolor. U myszy pigmentowanych RPE jest czarny. Pozostawić soczewkę na miejscu.
4. Użyć pipety transferowej, aby przenieść wypreparowaną siatkówkę do drugiej szalki 35 mm z pożywką.
5. Powtarzać kroki od 4.2 do 4.4, aż wszystkie oczy zostaną wypreparowane.
6. Przechowywać siatkówki w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C do momentu rozpoczęcia elektroporacji.

5. Przygotowanie do elektroporacji

1. Przygotuj szalki 35 mm z pożywką. Dla każdej alikwoty DNA przeznaczonej do elektroporacji potrzebna będzie jedna szalka z pożywką do sekcji oraz jedna szalka z pożywką hodowlaną (pożywka do sekcji z dodatkiem 10% FBS). Odpowiednio oznakuj szalki.
2. Używając pipety P200 i sterylnego 1X PBS, przepłucz komory w szalce do elektroporacji. Każda komora mieści objętość 60-100μl. Przepłucz każdą komorę trzykrotnie.
3. Wypełnij komory alikwotami DNA. Niewykorzystane komory należy wypełnić 60μl 1X PBS. Podłącz elektrody do szalki do elektroporacji.
4. Ustaw w elektroporatorze następujące parametry: tryb (mode), LV; napięcie (voltage), 30V; czas trwania impulsu (pulse length), 50 msec; liczba impulsów (number of pulses), 5; odstęp (interval), 950 msec; polaryzacja (polarity), unipolarna.

6. Elektroporacja

1. Używając precyzyjnej pęsety, chwyć siatkówki za soczewkę i przenieś je do komór elektroporacyjnych. Każda komora mieści do 3-4 siatkówek mysich (Ryc. 3).
2. Za pomocą pęsety ustaw siatkówki tak, aby soczewka opierała się o metalowy pręt przymocowany do elektrody dodatniej. Po każdym przeniesieniu oczyść pęsetę chusteczką Kimwipe, aby uniknąć przeniesienia DNA z jednej komory do drugiej.
3. Po wyrównaniu wszystkich siatkówek naciśnij przycisk „Start” w elektroporatorze. Na metalowym pręcie przymocowanym do elektrody ujemnej powinny pojawić się maleńkie pęcherzyki.
4. Odłącz elektrody i wyłącz elektroporator.
5. Za pomocą pęsety delikatnie odsuń siatkówki od ścianek komory.
6. Używając sterylnej pipety transferowej, przenieś siatkówki z komór do szalek 35mm zawierających medium do sekcji.
7. Przemyj każdą komorę trzykrotnie sterylnym 1X PBS, a następnie opłucz sterylną wodą. Spryskaj szalkę 70% etanolem.

7. Umieszczanie siatkówek na filtrach do hodowli

1. Używając pipety transferowej, przenieś siatkówki do szalek 35mm zawierających pożywkę hodowlaną.
2. Oznacz dołki w sterylnej 6-dołkowej płytce hodowlanej i wypełnij każdy dołek 3ml pożywki hodowlanej.
3. Za pomocą sterylnej pęsety umieść okrągłe filtry Whatman Nuclepore, stroną błyszczącą do góry, na powierzchni pożywki w każdym dołku.
4. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą sterylnej pipety transferowej, przenieś siatkówki na filtr, kładąc je stroną soczewki w dół. Jeśli siatkówka zostanie ułożona stroną soczewki do góry, podnieś ją pipetą i spróbuj ułożyć ponownie. Nie kładź więcej niż 4 siatkówki na jednym filtrze i upewnij się, że krople pożywki otaczające każdą siatkówkę pozostają oddzielone od pozostałych kropel. Należy zauważyć, że hodujemy siatkówkę z nienaruszoną soczewką, choć inne protokoły wymagają usunięcia soczewki przed tym krokiem⁹.
5. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C (5% CO₂) i inkubuj przez pożądany czas, zazwyczaj przez osiem dni. Według naszego doświadczenia wymiana pożywki nie jest konieczna podczas ośmiodniowego okresu hodowli, choć przy dłuższych okresach hodowli wymiana pożywki może być wymagana.

8. Pobieranie i montaż na płasko fluorescencyjnych eksplantów siatkówki

1. Wymień pożywkę w każdej studni na 4% paraformaldehyd w 1X PBS. Jeśli siatkówki pozostaną przyklejone do filtrów, użyj pęsety, aby obrócić filtry i delikatnie oddzielić siatkówki od filtra. Inkubuj w paraformaldehydzie przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Chronij siatkówki przed światłem, aby uniknąć wygaszenia fluorescencji.
2. Przepłucz siatkówki dwukrotnie przez 10 minut w 1X PBS.
3. Używając pipety jednorazowej, przenieś siatkówki na szkiełko przedmiotowe do małej kropli PBS. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym użyj pęsety, aby obrócić siatkówki tak, aby strona poddana elektroporacji była skierowana do góry (i.e., strona soczewki do dołu).
4. Umieść szklane „podpórki” wykonane z pokruszonych szkiełek nakrywkowych (odłamki szkła o średnicy około 1-2 mm) w narożnikach szkiełka; podpórki te zapobiegają spłaszczeniu siatkówki. Połóż nienaruszone szkiełko nakrywkowe nad szkiełkiem przedmiotowym w taki sposób, aby zakryło siatkówki i opierało się na podpórkach. W razie potrzeby użyj pipety, aby dodać więcej PBS pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką.

9. Obrazowanie i kwantyfikacja fluorescencji w preparacie typu flatmount

1. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu światłowodowego wyposażonego w kamerę monochromatyczną, aby obrazować siatkówkę w preparacie typu flatmount przy małym powiększeniu (obiektyw 4X) w kanałach czerwonym i zielonym. Wszystkie siatkówki muszą być obrazowane z tym samym czasem ekspozycji dla danego kanału fluorescencyjnego, aby umożliwić porównanie intensywności fluorescencji. Upewnij się, że piksele na żadnym z obrazów nie są nasycone, w przeciwnym razie dokładna kwantyfikacja będzie niemożliwa. Eksportuj obrazy w formacie TIFF w skali szarości.
2. Otwórz zestaw obrazów dla jednej siatkówki (t.j. kanał czerwony i kanał zielony) w programie ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Na potrzeby tego samouczka zielony kanał fluorescencyjny (białko GFP) jest konstruktem kontrolnym, który pozostaje stały dla wszystkich siatkówek w eksperymencie. Czerwony kanał fluorescencyjny (białko DsRed) jest konstruktem eksperymentalnym, który różni się dla każdego zestawu siatkówek. Obrazy powinny być w skali szarości.
3. W programie ImageJ wybierz kontrolny obraz zielony i określ okrąg zainteresowania o średnicy 100 jednostek (Analyze/Tools/ROI manager/More/Specify). Powiel ten okrąg (ROI manager/Add), aby utworzyć łącznie osiem okręgów. Przesuń okręgi 1-5, aby wybrać pięć obszarów, które zostały jednorodnie poddane elektroporacji, unikając zewnętrznych krawędzi siatkówki oraz obszaru nad soczewką (Rys. 4A). Wybierz również trzy obszary (okręgi 6-8) poza siatkówką/soczewką, aby zmierzyć fluorescencję tła. Wybierz obraz czerwony, odznacz pole „Show all” w ROI managerze, a następnie zaznacz je ponownie. Wszystkie osiem okręgów powinno pojawić się na obrazie czerwonym. Odznacz wszystkie współrzędne okręgów w ROI managerze.
4. Przy zaznaczonym obrazie czerwonym zapisz średnią wartość piksela dla wszystkich okręgów zainteresowania (ROI manager/Measure); powinny pojawić się pomiary 1-8, gdzie 1-5 to pomiary czerwone dla siatkówki, a 6-8 to pomiary czerwone dla tła. Wybierz obraz zielony i zapisz średnią wartość piksela; powinny pojawić się pomiary 9-16, gdzie 9-13 to pomiary zielone dla siatkówki, a 14-16 to pomiary zielone dla tła. Skopiuj dane pomiarowe do programu Excel w celu analizy (Rys. 5).
5. Oblicz średnią z trzech pomiarów tła zarówno dla kanału czerwonego, jak i zielonego. Odejmij średnią tła czerwonego od każdego z pięciu pomiarów siatkówki w kanale czerwonym; powtórz czynność dla kanału zielonego. Dla każdego obszaru zainteresowania siatkówki podziel pomiar czerwony po odjęciu tła przez pomiar zielony po odjęciu tła, aby znormalizować eksperymentalny poziom czerwony do kontrolnego poziomu zielonego (Rys. 5).
6. Wyznacz średnią i odchylenie standardowe wszystkich znormalizowanych pomiarów dla danego konstruktu DsRed (np. 5 pomiarów na siatkówkę pomnożone przez 3 oddzielne siatkówki). Aby ilościowo porównać wyniki elektroporacji przeprowadzonych w różne dni, zawsze dołączaj „standardową” precypitację DsRed/GFP do każdego zestawu elektroporacji. Względne wartości ekspresji w różnych eksperymentach można porównać poprzez normalizację do poziomu ekspresji tego „standardu”.

10. Reprezentatywne wyniki:

Prawidłowa elektroporacja skutkuje ekspresją konstruktów DNA na obszarze od 1/4 do 1/3 powierzchni siatkówki (Ryc. 4A). Ponieważ fotoreceptory pręcikowe są szczególnie wydajnie transdukowane, technika ta jest idealna do ilościowego określania aktywności promotorów specyficznych dla fotoreceptorów (Ryc. 4B). Wcześniej wykorzystaliśmy to podejście do ilościowej oceny szeregu wariantów promotorów z locus specyficznych dla pręcików Rho oraz Gnat1¹⁰. Stwierdziliśmy, że możliwe jest określenie aktywności promotora w zakresie niemal 300-krotnym.

Rysunek 5 przedstawia przykładowy zestaw danych z pojedynczej siatkówki poddanej elektroporacji. W tym konkretnym przykładzie konstrukt eksperymentalny pNrl(1.1kb)-DsRed był mierzony w kanale czerwonym, a konstrukt kontrolny pNrl(3.2kb)-GFP w kanale zielonym. Kompletny zestaw danych dla konstruktu pNrl(1.1kb)-DsRed składałby się z 6–9 siatkówek zmierzonych w ten sposób, a odchylenie standardowe byłoby obliczane na podstawie wszystkich wartości „DsRed znormalizowany do GFP”. Gdybyśmy porównywali poziom ekspresji pNrl(1.1kb)-DsRed na przykład z pNrl(0.8kb)-DsRed, oba konstrukty musiałyby zostać poddane elektroporacji z tym samym kontrolnym GFP (np. pNrl(3.2kb)-GFP) i obrazowane przy tych samych czasach ekspozycji. Możliwe jest łączenie danych zebranych w różne dni, jeśli każdego dnia przeprowadzana jest standardowa elektroporacja DsRed/GFP (np. pNrl(3.2kb)-dsRed + pNrl(3.2kb)-GFP). Dla każdego konstruktu eksperymentalnego znormalizowany poziom DsRed zostałby następnie znormalizowany względem znormalizowanego poziomu DsRed dla „standardu” (pNrl(3.2kb)-dsRed).

Opisana tutaj technika jest przede wszystkim przydatna do ilościowej oceny aktywności elementów regulacyjnych (CRE) fotoreceptorów^10,13. Aktywność regulacyjna cis> specyficzna dla danego typu komórek może być również mierzona w rzadszych typach komórek siatkówki, takich jak komórki dwubiegunowe¹⁴, jednak zazwyczaj wymaga to wyboru obszarów zainteresowania w przekrojach poprzecznych, a nie w preparatach rozwarstwionych (flatmount). To samo dotyczy CRE, które sterują ekspresją w wielu typach komórek, np. w fotoreceptorach i komórkach dwubiegunowych. Pozostałe procedury eksperymentalne są analogiczne.

Rysunek 1. Przegląd procedury elektroporacji eksplantów siatkówki. Po pierwsze, z mysich noworodków w dniu 0 po urodzeniu izoluje się całe gałki oczne, a następnie wycina się siatkówki (P1). Po drugie, siatkówki umieszcza się w komorach wypełnionych DNA i poddaje elektroporacji (P2). Po trzecie, siatkówki umieszcza się na filtrach i hoduje przez osiem dni (P3). Po czwarte, eksplanty siatkówki są utrwalane, montowane na szkiełkach i obrazowane. Intensywność fluorescencji jest mierzona przy użyciu oprogramowania ImageJ (P4). Po piąte, dane z programu ImageJ są przetwarzane w arkuszu kalkulacyjnym w celu ilościowego określenia różnic w aktywności poszczególnych promotorów (P5).

Rycina 2. Konstrukcja naczynia do elektroporacji. A) Niezmodyfikowana komora do mikropreparatów firmy Harvard Apparatus, model BTX 453 (numer katalogowy #45-0105). B) Przy użyciu narzędzia Dremel odcinany jest uchwyt z plastikowego statywu na probówki. Uchwyt jest pocięty na prostokątne przekładki o następujących wymiarach: długość 0,8cm, wysokość 0,6cm, szerokość 0,3cm. C) Plastikowe przekładki są rozmieszczane w komorze do mikropreparatów w równych odstępach. W szczeliny między przekładkami wstrzykuje się uszczelniacz akwarystyczny (nie pokazano). D) Nad przekładkami umieszcza się metalowy pręt. E) Pręt i przekładki są mocowane do preparatu za pomocą żabek biurowych, aby utrzymać wszystko na miejscu podczas wysychania uszczelniacza przez noc. F) Przekładki są usuwane, a szczelność otworów zostaje sprawdzona. G) Gotowy preparat pasuje do plastikowego naczynia, a metalowe pręty znajdują się obok okna w bocznej ścianie naczynia.

Rysunek 3. Schemat naczynia do elektroporacji z siatkówkami. Komory są wypełnione roztworami DNA (do pięciu różnych roztworów jednocześnie). Siatkówki są umieszczane w komorach i orientowane tak, aby soczewka opierała się o metalowy pręt połączony z elektrodą dodatnią; w każdej z pięciu komór zmieści się trzy lub cztery siatkówki. Prąd elektryczny spowoduje przemieszczenie ujemnie naładowanych cząsteczek DNA do wnętrza komórek siatkówki.

Rysunek 4. A) Pomiar poziomów fluorescencji siatkówki w preparacie typu flatmount za pomocą programu ImageJ. W oprogramowaniu ImageJ otwarto obrazy grayscale flatmount w kanałach DsRed (eksperymentalny) i GFP (kontrolny); należy zauważyć, że obrazy te zostały pokolorowane wyłącznie w celach ilustracyjnych. Pięć kół pomiarowych (od 1 do 5) umieszczono nad obszarami równomiernie poddawanymi elektroporacji, unikając krawędzi oraz soczewki (linie przerywane). Trzy koła pomiarowe (od 6 do 8) umieszczono poza siatkówką w celu określenia poziomu fluorescencji tła. B) Obrazy przekroju poprzecznego elektroporowanego eksplantu siatkówki przy dużym powiększeniu. Eksplant utrwalono w 8. dobie postnatalnej, krioprotekcyjnie w 30% sacharozy/1X PBS przez noc w temperaturze 4°C, zatopiono w OCT i wykonano kriostatyczne cięcia o grubości 12μm. Fluorescencyjne konstrukty pNrl(1.1kb)-DsRed i pNrl(3.2kb)-GFP są ekspresowane w komórkach fotoreceptorów w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL). INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; GCL, warstwa komórek zwojowych.

Rysunek 5. Przetwarzanie danych fluorescencyjnych w programie Excel. W kroku 1 średnia wartość piksela dla każdego okręgu pomiarowego jest kopiowana do arkusza kalkulacyjnego (komórki B3-B12, F3-F5, H3-H5). Pomiary nr 1-5 to wartości DsRed dla siatkówki, a nr 6-8 to wartości tła dla DsRed; pomiary nr 9-13 to wartości GFP dla siatkówki, a nr 14-16 to wartości tła dla GFP. Należy zauważyć, że pomiar nr 1 i nr 9 odpowiadają temu samemu okręgowi pomiarowemu, podobnie jak pomiary nr 2 i nr 10 itd. W kroku 2 obliczana jest średnia wartość tła dla kanałów DsRed i GFP (komórki F6, H6). W kroku 3 średnie tło jest odejmowane od każdego pomiaru siatkówki (komórki C3-C12). W kroku 4 każdy pomiar DsRed po odjęciu tła jest normalizowany do odpowiadającego mu pomiaru GFP (komórki D3-D7).

Dyskusja

Elektroporacja eksplantów jest prostym sposobem ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych w rozwijającej się siatkówce myszy. W porównaniu z analizą cis-regulacyjną za pomocą transgenezy mysiej, elektroporacja jest znacznie tańsza, wymagając jedynie noworodków myszy, DNA, narzędzi sekcyjnych oraz sprzętu do elektroporacji i hodowli tkankowej. Jest ona również znacznie mniej czasochłonna: jeden eksperyment wymaga zaledwie kilku godzin przygotowania, okresu hodowli wynoszącego około ośmiu dni oraz kilku godzin na koniec eksperymentu na obrazowanie i analizę danych. Elektroporacja eksplantów jest ponadto lepsza od analizy cis-regulacyjnej opartej na hodowlach komórkowych, ponieważ wykorzystuje ona rzeczywistą tkankę siatkówki. Siatkówka rozwija się w hodowli eksplantów dość prawidłowo – tworzy trzy wyraźne warstwy komórkowe (warstwę jądrową zewnętrzną, warstwę jądrową wewnętrzną i warstwę komórek zwojowych), choć fotoreceptory nie wykształcają segmentów zewnętrznych.

Kolejną zaletą jest to, że elektroporacja eksplantów jest wysoce powtarzalna. Elektroporacja tych samych konstruktów do różnych siatkówek, nawet w różne dni, zazwyczaj prowadzi do uzyskania tych samych względnych poziomów ekspresji. Ponadto, ponieważ uważa się, że elektroporowane plazmidy są utrzymywane episomalnie w jądrze komórkowym i nie są włączane do chromosomów, nie wydają się one podlegać tym samym efektom miejsca integracji, które utrudniają analizę elementów regulacyjnych cis przeprowadzaną u myszy transgenicznych.

Elektroporacja eksplantatów posiada kilka ograniczeń. Po pierwsze, jedynie komórki znajdujące się w cyklu komórkowym mogą zostać wydajnie transdukowane za pomocą elektroporacji.¹⁵W dniu P0 głównymi populacjami komórek objętymi tą metodą są pręciki oraz inne typy komórek siatkówki powstające w późniejszym etapie (komórki bipolarne, komórki amacryne, glej Müllera). Opisano również elektroporację fotoreceptorów czopkowych za pomocą elektroporacji w dniu P0.¹⁶ jednak wydajność wydaje się być niska. Drugim ograniczeniem jest fakt, że hodowla eksplantów powyżej dwóch tygodni prowadzi do postępującej deformacji siatkówki, w związku z czym nie jest ona zalecana. Jeśli jednak wymagana jest kwantyfikacja promotora w późniejszych punktach czasowych, to in vivo elektroporacja⁹ można przeprowadzić, a następnie wykonać dyssekcję siatkówki w wybranym punkcie czasowym, przygotować preparat siatkówki w metodzie flat-mount oraz przeprowadzić kwantyfikację zgodnie z opisem w sekcji 9. Trzecim ograniczeniem jest fakt, że test ten charakteryzuje się jedynie umiarkowaną przepustowością. W przeciwieństwie do testów opartych na kulturach komórkowych, które umożliwiają zbadanie setek konstruktów w jednym doświadczeniu, technika opisana w niniejszym protokole wymaga co najmniej jednej pełnej siatkówki myszy na konstrukt. W związku z tym w ciągu jednego dnia można racjonalnie poddać elektroporacji jedynie kilkanaście konstruktów.

Dodatkowym zastrzeżeniem dotyczącym ilościowego oznaczania aktywności promotora przy użyciu opisanego podejścia jest możliwość wystąpienia zjawiska „przesiąkania” (bleed-through) fluorescencji DsRed do kanału GFP, szczególnie podczas badania bardzo silnych promotorów. Wynika to z faktu, że widmo emisji DsRed częściowo pokrywa się z widmem emisji GFP. Aby uniknąć tego problemu, należy stosować zoptymalizowane filtry emisyjne, które minimalizują nakładanie się widm DsRed i GFP. W przypadku braku dostępu do takich zoptymalizowanych zestawów filtrów innym potencjalnym rozwiązaniem byłoby zastosowanie białka fluorescencyjnego o przesunięciu w stronę barwy niebieskiej (np. BFP lub CFP) zamiast GFP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalka do elektroporacji, Microslide 453	BTX Technologies	45-0105	Patrz sekcja 1 protokołu w celu wprowadzenia modyfikacji
100% silikonowy klej akwariowy	Perfecto Manufacturing
Plastikowy statyw na mikroprobówki	Fisher Scientific	05-541	Używany będzie tylko uchwyt statywu
Narzędzie Dremel			Do odcięcia uchwytu od plastikowego statywu na probówki
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11965
F12	GIBCO, by Life Technologies	11765
L-Glu/pen/strep	GIBCO, by Life Technologies	10378-016	stężenie 100X
Insulina	Sigma-Aldrich	I-6634	Dla roztworu stokowego 1000X resuspenderować w stężeniu 5mg/ml w 5mM HCl i wysterylizować przez filtr
FBS	GIBCO, by Life Technologies	26140-079
Elektroporator prostokątny ECM 830	BTX Technologies
Filtry Nuclepore	Whatman, GE Healthcare	110606	25mm, 0.2μm
Inkubator do hodowli tkankowych			37°C, 5% CO2
Szkiełka nakrywkowe nr 1.5	Fisher Scientific	12-544E	grubość 0.16mm
Fluorescencyjny mikroskop złożony wyposażony w kamerę			Kamera powinna być monochromatyczna (np., kamera ORCA-ER firmy Hamamatsu)
Zestaw filtrów EGFP/DsRed do mikroskopu złożonego	Chroma Technology Corp.	86007	Ten zestaw filtrów minimalizuje przenikanie sygnału między kanałem czerwonym a zielonym
Oprogramowanie ImageJ	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/