Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Streszczenie

Czynniki transkrypcyjne w komórkowych sieciach genowych kontrolują wzorce czasoprzestrzenne oraz poziomy ekspresji swoich genów docelowych poprzez wiązanie się z elementami regulacyjnymi cis (CREs), które są krótkimi (˜300-600 bp) odcinkami genomowego DNA znajdującymi się powyżej (upstream), poniżej (downstream) lub w obrębie intronów kontrolowanych przez nie genów. CREs (t.j. enhancery/promotory) zazwyczaj składają się z wielu zgrupowanych miejsc wiązania zarówno dla aktywatorów, jak i represorów transkrypcji^1-3. Służą one jako logiczne integratory sygnałów transkrypcyjnych, generując jednolity wynik w postaci czasoprzestrzennie precyzyjnej i ilościowo dokładnej aktywności promotora. Większość dotychczasowych badań nad regulacją cis u ssaków opierała się na transgenezie u myszy jako metodzie oceny funkcji enhancera CREs^4-5. Technika ta jest czasochłonna, kosztowna i ze względu na efekty miejsca insercji w dużej mierze nieilościowa. Z drugiej strony, ilościowe testy funkcji CRE u ssaków opracowano w systemach hodowli tkankowych (np. testy podwójnej lucyferazy), jednak znaczenie tych wyników in vivo jest często niepewne.

Elektroporacja stanowi doskonałą alternatywę dla tradycyjnej transgenezy u myszy, ponieważ umożliwia zarówno spatiotemporalną, jak i ilościową ocenę aktywności regulacyjnej cis w żywej tkance ssaków. Technika ta okazała się szczególnie użyteczna w analizie regulacji cis w ośrodkowym układzie nerwowym, zwłaszcza w korze mózgu i siatkówce^6-8. Choć elektroporacja siatkówki myszy, zarówno in vivo, jak i ex vivo, została opracowana i szczegółowo opisana przez Matsudę i Cepko^6-7,9, niedawno opracowaliśmy prostą metodę ilościowego pomiaru aktywności specyficznych dla fotoreceptorów elementów CRE w elektroporowanych siatkówkach myszy¹⁰. Biorąc pod uwagę, że ilość DNA wprowadzanego do siatkówki drogą elektroporacji może różnić się w zależności od eksperymentu, w każdym badaniu konieczne jest zastosowanie współelektroporowanej „kontroli załadunku”. Pod tym względem technika ta jest bardzo podobna do podwójnego testu lucyferazowego stosowanego do ilościowego pomiaru aktywności promotora w hodowlach komórkowych.

Podczas badania aktywności cis-regulatorowej fotoreceptorów elektroporację zazwyczaj przeprowadza się u noworodków myszy (0. dzień postnatalny, P0), co odpowiada okresowi szczytowej produkcji pręcików^11-12. Gdy typy komórek siatkówki stają się postmitotyczne, elektroporacja jest znacznie mniej wydajna. Biorąc pod uwagę wysoką stopę powstawania pręcików u noworodków myszy oraz fakt, że pręciki stanowią ponad 70% komórek w siatkówce dorosłej myszy, większość komórek poddanych elektroporacji w dniu P0 to pręciki. Z tego powodu fotoreceptory pręcikowe są najłatwiejszym do badania typem komórek siatkówki za pomocą elektroporacji. Technika opisana w niniejszym materiale jest przede wszystkim użyteczna do ilościowego określania aktywności elementów CRE fotoreceptorów.

Protokół

1. Konstrukcja komory do elektroporacji

1. Zamów mikroslajd, BTX Model 453 z przerwą 3,2mm (Harvard Apparatus #45-0105) (Rys. 2A). Metalowe szyny powinny być całkowicie uszczelnione na spodzie slajdu.
2. Użyj narzędzia Dremel, aby odciąć uchwyt z plastikowego statywu do mikroprobówek. Potnij uchwyt na 5 małych prostokątnych kawałków o następujących wymiarach: długość 0,8cm, wysokość 0,6cm, szerokość 0,3cm (Rys. 2B). Te plastikowe elementy są wielorazowymi dystansami, które posłużą do formowania poszczególnych studzienek w komorze mikroslajdu.
3. Wstaw plastikowe dystanse między metalowe szyny mikroslajdu w równych odstępach. Dystanse powinny pasować ściśle (Rys. 2C).
4. Odetnij końcówkę z tipa do pipety P200, dopasuj ją do strzykawki 3ml i napełnij strzykawkę 100% silikonowym uszczelniaczem akwariowym. Wypełnij szczeliny między plastikowymi dystansami uszczelniaczem. Należy wypełniać szczeliny od dołu, aby nie powstały pęcherzyki powietrza między korkiem z uszczelniacza a podstawą mikroslajdu.
5. Połóż metalowy pręt na plastikowych dystansach i przymocuj go żabkami biurowymi, aby dystanse pozostały na miejscu podczas schnięcia uszczelniacza (Rys. 2D-E). Pozostaw uszczelniacz do wyschnięcia na noc.
6. Zdejmij żabki biurowe, metalowy pręt oraz plastikowe dystanse (Rys. 2F). Użyj ostrza skalpela, aby oczyścić wierzch metalowych szyn z uszczelniacza. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zbadać mikroslajd i upewnić się, że na dnie silikonowych przegród nie ma pęcherzyków powietrza. Usuń wszelką błonę z uszczelniacza, która mogła powstać w studzienkach, tak aby w ich wnętrzu odsłonięty był czysty metal. Napełnij jedną studzienkę wodą i upewnij się, że woda nie przecieka do sąsiednich studni. Powtórz dla wszystkich studni.
7. Gotowy mikroslajd pasuje do plastikowejy szalki, przy czym metalowe słupki znajdują się obok okna w boku szalki (Rys. 2G); elektrody zostaną ostatecznie przytwierdzone do metalowych słupków.

2. Przygotowanie DNA

1. Dodać DNA plazmidowego do probówki mikrocentryfugi o pojemności 1.5mL na lodzie i uzupełnić objętość do 150μl wodą destylowaną. W celu ko-elektroporacji można połączyć wiele gatunków plazmidów (np. eksperymentalny konstrukt DsRed i kontrolny konstrukt GFP). Obliczając ilość DNA do dodania do probówki, należy pamiętać, że końcowa objętość alikwotu DNA wyniesie 60μl. Zazwyczaj każdy konstrukt stosuje się w końcowym stężeniu 0.5μg/μl.
2. Wytrącić DNA, dodając 15μl 3M octanu sodu (pH 5.2) oraz 450μl 100% etanolu. Odwrócić probówkę lub kilka razy nią stuknąć, aby wymieszać zawartość.
3. Wirować DNA w temperaturze 4°C przy 13,200 rpm przez 30 minut. Przemyć osad 70% etanolem, a następnie ponownie wirować w 4°C przy 13,200 rpm przez 15 minut. Suszyć osad na powietrzu do momentu, aż stanie się półprzezroczysty (około 7 minut), a następnie resuspender w 54μl sterylnej wody. Dodać 6μl sterylnego 10X PBS (pH 7.4) i wymieszać.

3. Pobieranie gałek ocznych

1. Zesterylizować komorę do elektroporacji oraz wszystkie instrumenty 70% etanolem. Choć pobieranie i sekcja oczu nie muszą być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy zdezynfekować rękawice oraz blat etanolem i starać się utrzymać sterylne warunki przez cały czas trwania procedury.
2. Przygotować szalki Petriego z pożywką do sekcji (stosunek 1:1 DMEM:F12, 100U/ml penicyliny, 100μg/ml streptomycyny, 0.29mg/ml L-glutaminy oraz 5μg/ml insuliny): dwie szalki 35mm, każda z 3ml pożywki, oraz jedną szalkę 60mm z 6ml pożywki. Ten krok należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
3. Zdezynfekować głowę i szyję nowo narodzonej myszy (dzień postnatalny 0) 70% etanolem. Szybko przeprowadzić dekapitację za pomocą nożyczek i przenieść głowę do sterylnej szalki 100mm.
4. Odciąć skórę głowy małymi nożyczkami, aby odsłonić oczy. Za pomocą zakrzywionej pęsety delikatnie wyjąć oko z oczodołu i umieścić je w szalce 35mm zawierającej pożywkę do sekcji. Pomocne może być usuwanie oczu pod mikroskopem sekcyjnym przy niskim powiększeniu.
5. Powtarzać kroki 3.3 i 3.4, aż do momentu pobrania wszystkich oczu. Przechowywać oczy w pożywce do sekcji w temperaturze pokojowej podczas przeprowadzania zabiegu. Na każdą alikwot DNA będzie potrzebnych 3-4 oczy.

4. Disekcja siatkówki

1. Użyj 70% etanolu do dezynfekcji żyletki oraz opakowania sterylnej plastikowej pipety transferowej. Odetnij końcówkę pipety za pomocą żyletki w taki sposób, aby można było w niej zassać całe oko. Przechowuj pipetę w plastikowym opakowaniu, gdy nie jest używana.
2. Przenieś jedno oko z szalki 35 mm do szalki 60 mm. Pod mikroskopem stereoskopowym przy dużym powiększeniu, za pomocą precyzyjnej pęsety usuń wszelkie tkanki, takie jak mięśnie pozagałkowe i tłuszcz, z powierzchni oka. Następnie usuń nerw wzrokowy, odcinając go poprzez ściśnięcie u nasady.
3. Aby wyizolować siatkówkę, wykonaj mały otwór w twardówce na wysokości limbusa. Wsuń jedno ramię każdej z dwóch pęset do otworu (stycznie do powierzchni siatkówki) i delikatnie rozerwij twardówkę/RPE. U myszy albinosów twardówka i RPE wydają się błyszczące w porównaniu do tkanki siatkówki, która ma jednolity matowo szary kolor. U myszy pigmentowanych RPE jest czarny. Pozostaw soczewkę na miejscu.
4. Użyj pipety transferowej, aby przenieść wypreparowaną siatkówkę do drugiej szalki 35 mm z pożywką.
5. Powtarzaj kroki od 4.2 do 4.4, aż wszystkie oczy zostaną wypreparowane.
6. Przechowuj siatkówki w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C do momentu rozpoczęcia elektroporacji.

5. Przygotowanie do elektroporacji

1. Przygotuj szalki 35 mm z pożywką. Dla każdej alikwoty DNA przeznaczonej do elektroporacji potrzebna będzie jedna szalka z pożywką do sekcji oraz jedna szalka z pożywką hodowlaną (pożywka do sekcji uzupełniona o 10% FBS). Odpowiednio opisz szalki.
2. Używając pipety P200 i sterylnego 1X PBS, wypłucz komory w szalce do elektroporacji. Każda komora mieści objętość 60-100μl. Wypłucz każdą komorę trzykrotnie.
3. Wypełnij komory alikwotami DNA. Niewykorzystane komory należy wypełnić 60μl 1X PBS. Podłącz elektrody do szalki do elektroporacji.
4. W elektroporatorze zastosuj następujące ustawienia: tryb, LV; napięcie, 30V; czas trwania impulsu, 50 msec; liczba impulsów, 5; odstęp, 950 msec; polaryzacja, jednobiegunowa.

6. Elektroporacja

1. Za pomocą precyzyjnej pęsety chwyć siatkówki za soczewkę i przenieś je do komór elektroporacyjnych. Każda komora mieści do 3-4 siatkówek myszy (Rys. 3).
2. Używając pęsety, ułóż siatkówki tak, aby soczewka opierała się o metalowy pręt przymocowany do elektrody dodatniej. Po każdym przeniesieniu oczyść pęsetę chusteczką Kimwipe, aby zapobiec przenoszeniu DNA z jednej komory do drugiej.
3. Po ustawieniu wszystkich siatkówek naciśnij przycisk „Start” w elektroporatorze. Na metalowym pręcie przymocowanym do elektrody ujemnej powinny pojawić się małe pęcherzyki powietrza.
4. Odłącz elektrody i wyłącz elektroporator.
5. Używając pęsety, ostrożnie odsun siatkówki od ścianek komory.
6. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieś siatkówki z komór do szalek 35 mm zawierających medium do sekcji.
7. Wypłucz każdą komorę trzykrotnie sterylnym 1X PBS, a następnie przemyj sterylną wodą. Spryskaj szalkę 70% etanolem.

7. Umieszczanie siatkówek na filtrach do hodowli

1. Za pomocą pipety transferowej przenieść siatkówki do szalek 35 mm zawierających pożywkę hodowlaną.
2. Opisać dołki sterylnej 6-dołkowej płytki hodowlanej i wypełnić każdy dołek 3 ml pożywki hodowlanej.
3. Używając sterylnej pęsety, umieścić okrągłe filtry Whatman Nuclepore stroną błyszczącą do góry na powierzchni pożywki w każdym dołku.
4. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą sterylnej pipety transferowej, przenieść siatkówki na filtr stroną soczewki do dołu. Jeśli siatkówka spocznie stroną soczewki do góry, należy ją podnieść pipetą i spróbować umieścić ją ponownie. Na jednym filtrze nie należy umieszczać więcej niż 4 siatkówek i należy upewnić się, że krople pożywki otaczające każdą siatkówkę pozostają oddzielone od pozostałych kropli. Należy zauważyć, że hodujemy siatkówkę z nienaruszoną soczewką, choć inne protokoły wymagają usunięcia soczewki przed tym krokiem⁹.
5. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C (5% CO₂) i hodować przez pożądany czas, zazwyczaj przez osiem dni. W naszym doświadczeniu wymiana pożywki w ciągu ośmiodniowego okresu hodowli nie jest konieczna, choć przy dłuższych okresach hodowli może być ona wymagana.

8. Zbieranie i przygotowywanie preparatów płaskich fluorescencyjnych eksplantów siatkówki

1. Wymień pożywkę w każdym dołku na 4% paraformaldehyd w 1X PBS. Jeśli siatkówki pozostaną przyklejone do filtrów, użyj pęsety, aby obrócić filtry i delikatnie odkleić siatkówki od filtra. Inkubuj w paraformaldehydzie przez 30 min w temperaturze pokojowej. Chroni siatkówki przed światłem, aby uniknąć blaknięcia fluorescencji.
2. Przepłucz siatkówki dwukrotnie przez 10 minut w 1X PBS.
3. Za pomocą jednorazowej pipety przenieś siatkówki na szkiełko przedmiotowe do małej kropli PBS. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereotypowym użyj pęsety, aby obrócić siatkówki tak, aby strona poddana elektroporacji była skierowana do góry (t.j. strona soczewki do dołu).
4. Umieść w rogach szkiełka szklane „nóżki” wykonane z pokruszonych szkiełek nakrywkowych (odłamki szkła o średnicy około 1-2 mm); nóżki te zapobiegają spłaszczeniu siatkówki. Połóż nienaruszone szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym tak, aby zakrywało siatkówki i opierało się na nóżkach. W razie potrzeby użyj pipety, aby dodać więcej PBS pomiędzy szkiełko przedmiotowe a nakrywkowe.

9. Obrazowanie i kwantyfikacja fluorescencji w preparacie typu flatmount

1. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu świetlnego wyposażonego w kamerę monochromatyczną, aby obrazować siatkówkę po rozłożeniu (flatmount) przy małym powiększeniu (obiektyw 4X) w kanałach czerwonym i zielonym. Wszystkie siatkówki muszą być obrazowane z tym samym czasem ekspozycji dla danego kanału fluorescencyjnego, aby umożliwić porównanie intensywności fluorescencji. Upewnij się, że piksele na żadnym obrazie nie są nasycone, w przeciwnym razie dokładna kwantyfikacja będzie niemożliwa. Eksportuj obrazy w formacie TIFF w skali szarości.
2. Otwórz zestaw obrazów dla jednej siatkówki (t.j. kanał czerwony i kanał zielony) w oprogramowaniu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Na potrzeby tego samouczka zielony kanał fluorescencyjny (białko GFP) jest konstruktem kontrolnym, który jest stały dla wszystkich siatkówek w eksperymencie. Czerwony kanał fluorescencyjny (białko DsRed) to konstrukt eksperymentalny, który różni się dla każdego zestawu siatkówek. Obrazy powinny być w skali szarości.
3. W programie ImageJ wybierz kontrolny obraz zielony i określ okrąg zainteresowania o średnicy 100 jednostek (Analyze/Tools/ROI manager/More/Specify). Powiel ten okrąg (ROI manager/Add), aby utworzyć łącznie osiem okręgów. Przesuń okręgi 1-5, aby wybrać pięć obszarów, które zostały równomiernie elektroporowane, unikając zewnętrznych krawędzi siatkówki oraz obszaru nad soczewką (Rys. 4A). Wybierz również trzy obszary (okręgi 6-8) poza siatkówką/soczewką, aby zmierzyć fluorescencję tła. Wybierz obraz czerwony, odznacz pole „Show all” w ROI manager, a następnie zaznacz je ponownie. Wszystkie osiem okręgów powinno pojawić się na obrazie czerwonym. Odznacz wszystkie współrzędne okręgów w ROI manager.
4. Przy zaznaczonym obrazie czerwonym zarejestruj średnią wartość piksela dla wszystkich okręgów zainteresowania (ROI manager/Measure); powinny pojawić się pomiary 1-8, gdzie 1-5 to pomiary czerwone z siatkówki, a 6-8 to pomiary czerwonego tła. Wybierz obraz zielony i zarejestruj średnią wartość piksela; powinny pojawić się pomiary 9-16, gdzie 9-13 to pomiary zielone z siatkówki, a 14-16 to pomiary zielonego tła. Skopiuj dane pomiarowe do programu Excel w celu analizy (Rys. 5).
5. Oblicz średnią z trzech pomiarów tła zarówno dla kanału czerwonego, jak i zielonego. Odejmij średnią tła czerwonego od każdego z pięciu pomiarów siatkówki w kanale czerwonym; powtórz czynność dla kanału zielonego. Dla każdego obszaru zainteresowania siatkówki podziel pomiar czerwony po odjęciu tła przez pomiar zielony po odjęciu tła, aby znormalizować eksperymentalny poziom czerwieni do kontrolnego poziomu zieleni (Rys. 5).
6. Wyznacz średnią i odchylenie standardowe wszystkich znormalizowanych pomiarów dla danego konstruktu DsRed (np. 5 pomiarów na siatkówkę pomnożone przez 3 oddzielne siatkówki). Aby ilościowo porównać wyniki elektroporacji przeprowadzonych w różne dni, zawsze dołączaj „standardową” precypitację DsRed/GFP do każdego zestawu elektroporacji. Wartości ekspresji względnej w różnych eksperymentach można porównać poprzez normalizację do poziomu ekspresji tego „standardu”.

10. Reprezentatywne wyniki:

Prawidłowa elektroporacja skutkuje ekspresją konstruktu(ów) DNA na obszarze od 1/4 do 1/3 powierzchni siatkówki (Rys. 4A). Ponieważ fotoreceptory pręcikowe są szczególnie wydajnie transdukowane, technika ta jest idealna do ilościowego oznaczania aktywności promotorów specyficznych dla fotoreceptorów (Rys. 4B). Wcześniej wykorzystaliśmy to podejście do ilościowego oznaczenia szeregu wariantów promotorów z locus Rho oraz Gnat1 specyficznych dla pręcików¹⁰. Stwierdziliśmy, że możliwe jest ilościowe oznaczenie aktywności promotora w zakresie niemal 300-krotnym.

Rysunek 5 przedstawia przykładowy zestaw danych z pojedynczej siatkówki poddanej elektroporacji. W tym konkretnym przykładzie konstrukt eksperymentalny pNrl(1.1kb)-DsRed był mierzony w kanale czerwonym, a konstrukt kontrolny pNrl(3.2kb)-GFP w kanale zielonym. Pełny zestaw danych dla konstruktu pNrl(1.1kb)-DsRed składałby się z 6-9 siatkówek zmierzonych w ten sposób, a odchylenie standardowe zostałoby obliczone na podstawie wszystkich wartości „DsRed znormalizowanego do GFP”. Gdybyśmy porównywali poziom ekspresji pNrl(1.1kb)-DsRed na przykład z pNrl(0.8kb)-DsRed, oba konstrukty musiałyby zostać poddane elektroporacji z tym samym kontrolnym GFP (np. pNrl(3.2kb)-GFP) i obrazowane przy tych samych czasach ekspozycji. Możliwe jest łączenie danych zebranych w różne dni, jeśli każdego dnia przeprowadzana jest standardowa elektroporacja DsRed/GFP (np. pNrl(3.2kb)-dsRed + pNrl(3.2kb)-GFP). Dla każdego konstruktu eksperymentalnego znormalizowany poziom DsRed zostałby następnie znormalizowany do znormalizowanego poziomu DsRed „standardu” (pNrl(3.2kb)-dsRed).

Opisana tutaj technika jest przede wszystkim przydatna do ilościowej oceny aktywności elementów regulatorowych cis (CRE) fotoreceptorów.^10,13Specyficzne dla typu komórek cis– aktywność regulacyjną można również określić ilościowo w rzadszych typach komórek siatkówki, takich jak komórki bipolarne¹⁴wymaga to jednak zazwyczaj wyboru obszarów zainteresowania do kwantyfikacji w przekrojach pionowych, a nie w preparatach typu flatmount. To samo dotyczy elementów regulacyjnych cis- (CRE), które sterują ekspresją w wielu typach komórek, takich jak fotoreceptory i komórki bipolarne. Pozostałe procedury eksperymentalne są analogiczne.

Rycina 1. Przegląd procedury elektroporacji eksplantów siatkówki. Po pierwsze, całe gałki oczne są izolowane z mysich piskląt w 0. dniu po urodzeniu, a następnie przeprowadzana jest dyssekcja siatkówek (P1). Po drugie, siatkówki są umieszczane w komorach wypełnionych DNA i poddawane elektroporacji (P2). Po trzecie, siatkówki są nakładane na filtry i hodowane przez osiem dni (P3). Po czwarte, eksplanty siatkówki są utrwalane, montowane na szkiełkach i obrazowane. Natężenie fluorescencji jest mierzone za pomocą oprogramowania ImageJ (P4). Po piąte, dane z programu ImageJ są przetwarzane w programie arkusza kalkulacyjnego w celu ilościowego określenia różnic w aktywności poszczególnych promotorów (P5).

Rycina 2. Konstrukcja naczynia do elektroporacji. A) Niekorygowana komora do mikroslajdów firmy Harvard Apparatus, model BTX 453 (katalog #45-0105). B) Narzędzie Dremel służy do odcięcia uchwytu z plastikowego statywu na probówki. Uchwyt jest cięty na prostokątne dystanse o następujących wymiarach: długość 0.8cm, wysokość 0.6cm, szerokość 0.3cm. C) Plastikowe dystanse są montowane w komorze mikroslajdu w równych odstępach. W szczeliny między dystansami wstrzykiwany jest uszczelniacz akwarystyczny (nie pokazano). D) Metalowy pręt zostaje umieszczony nad dystansami. E) Pręt i dystanse są przymocowane do slajdu za pomocą żabek biurowych, aby utrzymać wszystko na miejscu podczas nocnego schnięcia uszczelniacza. F) Dystanse zostają usunięte, a szczelność studzienek zostaje sprawdzona. G) Gotowy slajd pasuje do plastikowego naczynia, przy czym metalowe pręty znajdują się obok okna w bocznej ściance naczynia.

Rysunek 3. Schemat naczynia do elektroporacji z siatkówkami. Komory są wypełnione roztworami DNA (do pięciu różnych roztworów jednocześnie). Siatkówki umieszcza się w komorach i orientuje tak, aby soczewka opierała się o metalowy pręt połączony z elektrodą dodatnią; w każdej z pięciu komór zmieści się trzy lub cztery siatkówki. Prąd elektryczny spowoduje przemieszczenie ujemnie naładowanych cząsteczek DNA do komórek siatkówki.

Rysunek 4. A) Pomiar poziomów fluorescencji siatkówki w preparacie typu flatmount za pomocą programu ImageJ. W programie ImageJ otwarto obrazy w skali szarości preparatu flatmount w kanałach DsRed (eksperymentalnym) i GFP (kontrolnym); należy zauważyć, że obrazy te zostały pokolorowane wyłącznie w celach ilustracyjnych. Pięć okręgów pomiarowych (od 1 do 5) umieszczono nad jednorodnie elektroporowanymi obszarami, unikając krawędzi oraz soczewki (linie przerywane). Trzy okręgi pomiarowe (od 6 do 8) umieszczono poza siatkówką w celu określenia poziomu fluorescencji tła. B) Obrazy przekroju poprzecznego elektroporowanego eksplantu siatkówki przy dużym powiększeniu. Eksplant utrwalono w 8. dobie po urodzeniu, poddano krioprotekcji w 30% sucrose/1X PBS przez noc w temperaturze 4°C, zatopiono w OCT i wykonano kriosekcje o grubości 12μm. Fluorescencyjne konstrukty pNrl(1.1kb)-DsRed i pNrl(3.2kb)-GFP wykazują ekspresję w komórkach fotoreceptorów w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL). INL – wewnętrzna warstwa jądrowa; GCL – warstwa komórek zwojowych.

Rysunek 5. Przetwarzanie danych fluorescencyjnych przy użyciu programu Excel. W kroku 1 średnia wartość piksela dla każdego okręgu pomiarowego jest kopiowana do arkusza kalkulacyjnego (komórki B3-B12, F3-F5, H3-H5). Pomiary nr 1-5 to wartości DsRed z siatkówki, a nr 6-8 to wartości tła dla DsRed; pomiary nr 9-13 to wartości GFP z siatkówki, a nr 14-16 to wartości tła dla GFP. Należy zauważyć, że pomiary nr 1 i 9 odpowiadają temu samemu okręgowi pomiarowemu, podobnie jak pomiary nr 2 i 10 itd. W kroku 2 obliczana jest średnia wartość tła dla kanałów DsRed i GFP (komórki F6, H6). W kroku 3 średnie tło jest odejmowane od każdego pomiaru z siatkówki (komórki C3-C12). W kroku 4 każdy pomiar DsRed po odjęciu tła jest normalizowany do odpowiadającego mu pomiaru GFP (komórki D3-D7).

Dyskusja

Elektroporacja eksplantów jest prostym sposobem ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych w rozwijającej się siatkówce myszy. W porównaniu z analizą cis-regulacyjną za pomocą transgenezy mysiej, elektroporacja jest znacznie tańsza, wymagając jedynie noworodków myszy, DNA, narzędzi sekcyjnych oraz sprzętu do elektroporacji i hodowli tkankowej. Jest ona również znacznie mniej czasochłonna: jeden eksperyment wymaga zaledwie kilku godzin przygotowania, okresu hodowli wynoszącego około ośmiu dni oraz kilku godzin na koniec eksperymentu na obrazowanie i analizę danych. Elektroporacja eksplantów jest ponadto lepsza od analizy cis-regulacyjnej opartej na hodowlach komórkowych, ponieważ wykorzystuje ona rzeczywistą tkankę siatkówki. Siatkówka rozwija się w hodowli eksplantów dość prawidłowo – tworzy trzy wyraźne warstwy komórkowe (warstwę jądrową zewnętrzną, warstwę jądrową wewnętrzną i warstwę komórek zwojowych), choć fotoreceptory nie wykształcają segmentów zewnętrznych.

Kolejną zaletą jest to, że elektroporacja eksplantów jest wysoce powtarzalna. Elektroporacja tych samych konstruktów do różnych siatkówek, nawet w różne dni, zazwyczaj prowadzi do uzyskania tych samych względnych poziomów ekspresji. Ponadto, ponieważ uważa się, że elektroporowane plazmidy są utrzymywane episomalnie w jądrze komórkowym i nie są włączane do chromosomów, nie wydają się one podlegać tym samym efektom miejsca integracji, które utrudniają analizę elementów regulacyjnych cis przeprowadzaną u myszy transgenicznych.

Elektroporacja eksplantatów posiada kilka ograniczeń. Po pierwsze, jedynie komórki znajdujące się w cyklu komórkowym mogą zostać wydajnie transdukowane za pomocą elektroporacji.¹⁵W dniu P0 głównymi populacjami komórek objętymi tą metodą są pręciki oraz inne typy komórek siatkówki powstające w późniejszym etapie (komórki bipolarne, komórki amacryne, glej Müllera). Opisano również elektroporację fotoreceptorów czopkowych za pomocą elektroporacji w dniu P0.¹⁶ jednak wydajność wydaje się być niska. Drugim ograniczeniem jest fakt, że hodowla eksplantów powyżej dwóch tygodni prowadzi do postępującej deformacji siatkówki, w związku z czym nie jest ona zalecana. Jeśli jednak wymagana jest kwantyfikacja promotora w późniejszych punktach czasowych, to in vivo elektroporacja⁹ można przeprowadzić, a następnie wykonać dyssekcję siatkówki w wybranym punkcie czasowym, przygotować preparat siatkówki w metodzie flat-mount oraz przeprowadzić kwantyfikację zgodnie z opisem w sekcji 9. Trzecim ograniczeniem jest fakt, że test ten charakteryzuje się jedynie umiarkowaną przepustowością. W przeciwieństwie do testów opartych na kulturach komórkowych, które umożliwiają zbadanie setek konstruktów w jednym doświadczeniu, technika opisana w niniejszym protokole wymaga co najmniej jednej pełnej siatkówki myszy na konstrukt. W związku z tym w ciągu jednego dnia można racjonalnie poddać elektroporacji jedynie kilkanaście konstruktów.

Dodatkowym zastrzeżeniem dotyczącym ilościowego oznaczania aktywności promotora przy użyciu opisanego podejścia jest możliwość wystąpienia zjawiska „przesiąkania” (bleed-through) fluorescencji DsRed do kanału GFP, szczególnie podczas badania bardzo silnych promotorów. Wynika to z faktu, że widmo emisji DsRed częściowo pokrywa się z widmem emisji GFP. Aby uniknąć tego problemu, należy stosować zoptymalizowane filtry emisyjne, które minimalizują nakładanie się widm DsRed i GFP. W przypadku braku dostępu do takich zoptymalizowanych zestawów filtrów innym potencjalnym rozwiązaniem byłoby zastosowanie białka fluorescencyjnego o przesunięciu w stronę barwy niebieskiej (np. BFP lub CFP) zamiast GFP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalka do elektroporacji, Microslide 453	BTX Technologies	45-0105	Patrz sekcja 1 protokołu w celu wprowadzenia modyfikacji
100% silikonowy klej akwariowy	Perfecto Manufacturing
Plastikowy statyw na mikroprobówki	Fisher Scientific	05-541	Używany będzie tylko uchwyt statywu
Narzędzie Dremel			Do odcięcia uchwytu od plastikowego statywu na probówki
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11965
F12	GIBCO, by Life Technologies	11765
L-Glu/pen/strep	GIBCO, by Life Technologies	10378-016	stężenie 100X
Insulina	Sigma-Aldrich	I-6634	Dla roztworu stokowego 1000X resuspenderować w stężeniu 5mg/ml w 5mM HCl i wysterylizować przez filtr
FBS	GIBCO, by Life Technologies	26140-079
Elektroporator prostokątny ECM 830	BTX Technologies
Filtry Nuclepore	Whatman, GE Healthcare	110606	25mm, 0.2μm
Inkubator do hodowli tkankowych			37°C, 5% CO2
Szkiełka nakrywkowe nr 1.5	Fisher Scientific	12-544E	grubość 0.16mm
Fluorescencyjny mikroskop złożony wyposażony w kamerę			Kamera powinna być monochromatyczna (np., kamera ORCA-ER firmy Hamamatsu)
Zestaw filtrów EGFP/DsRed do mikroskopu złożonego	Chroma Technology Corp.	86007	Ten zestaw filtrów minimalizuje przenikanie sygnału między kanałem czerwonym a zielonym
Oprogramowanie ImageJ	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/