Kwantyfikacja aktywności elementów cis-regulatorowych w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantacyjnej.

1. Budowa komory elektroporacyjnej

1. Zamów mikroszkiełko BTX Model 453 ze szczeliną 3,2 mm (Harvard Apparatus #45-0105) (rys. 2A). Metalowe szyny powinny być całkowicie uszczelnione do dolnej części zjeżdżalni.
2. Za pomocą narzędzia Dremel odetnij uchwyt z plastikowego stojaka na probówki do mikrowirówek. Pokrój rączkę na 5 małych prostokątnych kawałków, każdy o następujących wymiarach: długość 0,8 cm, wysokość 0,6 cm, szerokość 0,3 cm (rys. 2B). Te plastikowe elementy są przekładkami wielokrotnego użytku, które posłużą do formowania poszczególnych studzienek w komorze mikrozjeżdżalni.
3. Włóż plastikowe przekładki między metalowe szyny mikroprowadnicy w równych odstępach. Przekładki powinny być dobrze dopasowane (rys. 2C).
4. Odetnij końcówkę końcówki pipety P200, dopasuj końcówkę do strzykawki o pojemności 3 ml i napełnij strzykawkę 100% uszczelniaczem akwariowym z gumy silikonowej. Wypełnij szczeliny między plastikowymi przekładkami szczeliwem. Pamiętaj, aby wypełnić szczeliny od dołu do góry, aby między zatyczką szczeliwa a podstawą mikroszkiełka nie tworzyły się pęcherzyki.
5. Umieść metalowy pręt na plastikowych przekładkach i przymocuj go za pomocą spinaczy do segregatorów, tak aby przekładki były utrzymywane na miejscu podczas wysychania szczeliwa (rys. 2D-E). Pozostaw szczeliwo do wyschnięcia na noc.
6. Usuń spinki do segregatorów, metalowy pręt i plastikowe przekładki (rys. 2F). Użyj ostrza skalpela, aby usunąć szczeliwo z górnej części metalowych szyn. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zbadać mikroszkiełko i upewnij się, że na dnie silikonowych zapór nie ma pęcherzyków. Usuń wszelką warstwę szczeliwa, która mogła powstać w studzienkach, tak że odsłonięty metal jest odsłonięty wewnątrz studzienek. Napełnij jedną studzienkę wodą i upewnij się, że woda nie przecieka do sąsiedniej studni (studni). Powtórz dla wszystkich dołków.
7. Gotowy mikroszkiełko mieści się w plastikowym naczyniu z metalowymi słupkami przylegającymi do okienka z boku naczynia (rys. 2G); elektrody zostaną ostatecznie przymocowane do metalowych biegunów.

2. Przygotowanie DNA

1. Dodaj plazmidowe DNA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie i zwiększ objętość do 150 μl wodą destylowaną. Wiele gatunków plazmidów może być łączonych w celu koelektroporacji (np. eksperymentalny konstrukt DsRed i kontrolny konstrukt GFP). Obliczając ilość DNA do dodania do probówki, należy pamiętać, że końcowa objętość podwielokrotności DNA wyniesie 60 μl. Zazwyczaj każdy konstrukt jest używany w końcowym stężeniu 0,5 μg/μl.
2. Wytrącić DNA, dodając 15 μl octanu sodu 3M (pH 5,2) i 450 μl 100% etanolu. Odwróć lub postukaj w rurkę kilka razy, aby wymieszać.
3. Wiruj DNA w temperaturze 4°C, 13 200 obr./min, przez 30 minut. Umyj granulat 70% etanolem, a następnie ponownie odwiruj w temperaturze 4°C, 13 200 obr./min, przez 15 minut. Wysuszyć granulkę na powietrzu, aż stanie się półprzezroczysta, około 7 minut, a następnie ponownie zawiesić w 54 μl sterylnej wody. Dodaj 6 μl sterylnego 10X PBS (pH 7,4) i wymieszaj.

3. Kolekcja oczu

1. Wysterylizuj komorę elektroporacyjną i wszystkie narzędzia 70% etanolem. Chociaż pobieranie i sekcja oczu nie muszą być wykonywane w kapturze do hodowli tkankowej, zdezynfekuj rękawice i stół etanolem i staraj się utrzymać sterylne warunki przez cały czas trwania zabiegu.
2. Przygotuj szalki Petriego z pożywką separacyjną (stosunek 1:1 DMEM:F12, 100 μg / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny, 0,29 mg / ml L-glutaminy i 5 μg / ml insuliny): dwie szalki 35 mm każda z 3 ml pożywki i jedna szalka 60 mm z 6 ml pożywki. Ten etap należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej.
3. Zdezynfekuj głowę i szyję nowonarodzonego (0. dzień po urodzeniu) szczeniaka myszy za pomocą 70% etanolu. Szybko odetnij głowę nożyczkami i przenieś głowę do sterylnego naczynia o średnicy 100 mm.
4. Odetnij skórę głowy małymi nożyczkami, aby odsłonić oczy. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie zgarnąć oko z oczodołu i umieść oko w 35-milimetrowym naczyniu zawierającym podłoże do preparacji. Pomocne może być usunięcie oczu pod mikroskopem preparacyjnym o niskiej mocy.
5. Powtarzaj kroki 3.3 i 3.4, aż wszystkie oczy zostaną zebrane. Podczas preparacji trzymaj oczy w pożywce preparacyjnej w temperaturze pokojowej. Będziesz potrzebował 3-4 oczu na podwielokrotność DNA.

4. Rozwarstwienie siatkówki

1. Użyj 70% etanolu do dezynfekcji zarówno żyletki, jak i opakowania sterylnej plastikowej pipety transferowej. Odetnij końcówkę pipety z ostrzem, aby mogła zassać całe oko. Pipetę należy przechowywać w plastikowym opakowaniu, gdy nie jest używana.
2. Przenieś jedno oko z czaszy 35 mm na czaszę 60 mm. Pod mikroskopem preparacyjnym o dużej mocy użyj cienkich kleszczy, aby usunąć wszelkie tkanki, takie jak mięśnie zewnątrzgałkowe i tłuszcz, z powierzchni oka. Następnie usuń nerw wzrokowy, ściskając go u podstawy.
3. Aby odizolować siatkówkę, należy zrobić mały otwór w twardówce w rąbku. Włóż po jednym bolcu z obu par kleszczy do otworu (stycznego do powierzchni siatkówki) i delikatnie rozerwij twardówkę/RPE. U myszy albinosów twardówka i RPE wydają się błyszczące w stosunku do tkanki siatkówki, która ma jednorodny matowy szary kolor. U myszy pigmentowanych RPE jest. Pozostaw soczewkę na miejscu.
4. Użyj pipety transferowej, aby przenieść wypreparowaną siatkówkę do drugiej płytki 35 mm z podłożem.
5. Powtarzaj kroki od 4.2 do 4.4, aż wszystkie oczy zostaną wycięte.
6. Przechowuj siatkówki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C do czasu, gdy będziesz gotowy do elektroporacji.

5. Przygotowanie do elektroporacji

1. Przygotuj naczynia o średnicy 35 mm. Dla każdej podwielokrotności DNA, która ma być poddana elektroporacji, potrzebne jest jedno naczynie pożywki preparacyjnej i jedna pożywka hodowlana (pożywka preparcyjna plus 10% FBS). Odpowiednio oznacz naczynia
.
2. Użyj pipety P200 i sterylnego 1X PBS, aby wypłukać komory w naczyniu do elektroporacji. Każda komora mieści objętość 60-100 μl. Umyj każdą komorę trzy razy.
3. Wypełnij komory porcjami DNA. Wszelkie niewykorzystane komory należy wypełnić 60μl 1X PBS. Podłącz elektrody do naczynia do elektroporacji.
4. Użyj następujących ustawień elektroportora: tryb, LV; napięcie, 30 V; długość impulsu, 50 ms; liczba impulsów, 5; interwał, 950 ms; polaryzacja, unipolarny.

6. Elektroporacja

1. Użyj cienkich kleszczyków, aby chwycić siatkówki za soczewkę i przenieść je do komór elektroporacyjnych. Każda komora mieści do 3-4 siatkówek myszy (ryc. 3).
2. Użyj kleszczyków, aby wyrównać siatkówki tak, aby soczewka opierała się o metalowy pręt przymocowany do elektrody dodatniej. Wyczyść kleszcze chusteczką Kimwipe po każdym transferze, aby uniknąć przenoszenia DNA z jednej komory do drugiej.
3. Gdy wszystkie siatkówki zostaną wyrównane, naciśnij "Start" na elektroporatorze. Na metalowym pręcie przymocowanym do elektrody ujemnej powinny tworzyć się drobne pęcherzyki.
4. Odłącz elektrody i wyłącz elektroporator.
5. Użyj kleszczyków, aby delikatnie odsunąć siatkówki od ścian komory.
6. Użyj sterylnej pipety transferowej, aby przenieść siatkówki z komór do 35-milimetrowych szalek zawierających pożywkę preparacyjną
.
7. Umyj każdą komorę trzykrotnie sterylnym 1X PBS, a następnie spłucz sterylną wodą. Spryskaj naczynie 70% etanolem.

7. Umieszczanie siatkówki na filtrach do hodowli

1. Użyj pipety transferowej, aby przenieść siatkówki do szalek o średnicy 35 mm zawierających pożywkę hodowlaną.
2. Oznacz studzienki sterylnej 6-dołkowej płytki hodowlanej i napełnij każdą studzienkę 3 ml pożywki hodowlanej.
3. Użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić okrągłe filtry Whatman Nuclepore, błyszczącą stroną do góry, na pożywce w każdym dołku.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj sterylnej pipety transferowej, aby przenieść siatkówki na filtr, stroną z soczewką do dołu. Jeśli siatkówka wyląduje soczewką do góry, podnieś ją pipetą i spróbuj umieścić ją ponownie. Nie umieszczaj więcej niż 4 siatkówki na jednym filtrze i upewnij się, że kropelki podłoża otaczające każdą siatkówkę pozostają oddzielone od innych kropel. Należy pamiętać, że hodujemy siatkówkę z nienaruszoną soczewką, chociaż inne protokoły wymagają usunięcia soczewki przed tym krokiem⁹.
5. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C (5% CO₂) i hoduj przez żądany czas, zwykle osiem dni. Z naszego doświadczenia wynika, że zmiana pożywki nie jest konieczna podczas ośmiodniowego okresu hodowli, chociaż zmiana pożywki może być wymagana w przypadku dłuższych okresów hodowli.

8. Zbieranie i płaski fluorescencyjny eksplantat siatkówki

1. Zastąp pożywkę hodowlaną w każdym dołku 4% paraformaldehydem / 1X PBS. Jeśli siatkówki pozostają przyklejone do filtrów, użyj kleszczyków, aby odwrócić filtry i delikatnie oderwij siatkówki od filtra. Inkubować w paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chroń siatkówki przed światłem, aby uniknąć wybielania fluorescencji.
2. Przepłucz siatkówki dwukrotnie przez 10 minut w 1X PBS.
3. Użyj jednorazowej pipety, aby przenieść siatkówki na szklane szkiełko w małej kropli PBS. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby obrócić siatkówki tak, aby były elektroporowane stroną do góry (tj. soczewką do dołu).
4. Szklane "nóżki" wykonane ze zmiażdżonych szkiełek nakrywkowych (odłamków szkła o średnicy około 1-2 mm) należy umieścić w rogach szkiełka; nóżki te zapobiegają spłaszczeniu siatkówki. Umieść nienaruszone szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełku tak, aby zakrywało siatkówki i spoczywało na stopach. W razie potrzeby użyj pipety, aby dodać więcej PBS między szkiełko podstawowe a szkiełko nakrywkowe.

9. Obrazowanie i kwantyfikacja fluorescencji w flatmount

1. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu złożonego wyposażonego w monochromatyczną kamerę, aby zobrazować płasko zamontowaną siatkówkę przy małej mocy (obiektyw 4X) w kanałach czerwonym i zielonym. Wszystkie siatkówki muszą być zobrazowane z tym samym czasem ekspozycji dla danego kanału fluorescencyjnego, aby umożliwić porównanie intensywności fluorescencji. Upewnij się, że piksele nie są nasycone na żadnym obrazie, w przeciwnym razie dokładna kwantyfikacja będzie niemożliwa. Eksportuj obrazy w formacie TIFF w skali szarości.
2. Otwórz zestaw obrazów dla jednej siatkówki (tj. kanału czerwonego i kanału zielonego) w oprogramowaniu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Na potrzeby tego samouczka zielony kanał fluorescencyjny (białko GFP) jest konstruktem kontrolnym, który jest stały we wszystkich siatkówkach w eksperymencie. Kanał czerwonej fluorescencji (białko DsRed) jest konstruktem eksperymentalnym, który różni się dla każdego zestawu siatkówki. Obrazy powinny być w skali szarości.
3. W ImageJ wybierz zielony obraz kontrolny i określ interesujący Cię okrąg o średnicy 100 jednostek (Analyze/Tools/ROI manager/More/Specify). Zduplikuj ten okrąg (menedżer ROI/Dodaj), aby utworzyć łącznie osiem kręgów. Przesuwaj okręgi 1-5, aby wybrać pięć obszarów, które są równomiernie elektroporowane, omijając zewnętrzne krawędzie siatkówki i obszar pokrywający soczewkę (ryc. 4A). Wybierz również trzy obszary (okręgi 6-8) poza siatkówką/soczewką, aby zmierzyć fluorescencję tła. Wybierz czerwony obraz, odznacz pole "Pokaż wszystko" w menedżerze ROI i ponownie zaznacz pole. Na czerwonym obrazie powinno pojawić się wszystkie osiem okręgów. Usuń zaznaczenie wszystkich współrzędnych okręgu w menedżerze ROI.
4. Po wybraniu czerwonego obrazu zapisz średnią wartość piksela dla wszystkich interesujących okręgów (menedżer ROI/Pomiar); powinny pojawić się pomiary 1-8, gdzie 1-5 to wymiary czerwonej siatkówki, a 6-8 to pomiary czerwonego tła. Wybierz zielony obraz i zapisz średnią wartość piksela; Powinny pojawić się wymiary 9-16, gdzie 9-13 to zielone wymiary siatkówki, a 14-16 to wymiary zielonego tła. Skopiuj dane pomiarowe do Excela w celu analizy (rys. 5).
5. Uśrednij trzy pomiary tła zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym. Odejmij średnią czerwonego tła od każdego z pięciu pomiarów siatkówki w kanale czerwonym; Powtórz te czynności dla kanału zielonego. Dla każdego obszaru zainteresowania siatkówki podziel pomiar koloru czerwonego odjętego tłem przez pomiar koloru zielonego odjętego tłem, aby znormalizować eksperymentalny poziom czerwieni do kontrolnego poziomu zieleni (ryc. 5).
6. Określ średnią i odchylenie standardowe wszystkich znormalizowanych pomiarów dla danego konstruktu DsRed (np. 5 pomiarów na siatkówkę razy 3 oddzielne siatkówki). W celu ilościowego porównania wyników elektroporacji przeprowadzonych w różnych dniach, w każdym zestawie do elektroporacji należy zawsze dołączyć "standardowe" wytrącanie DsRed/GFP. Względne wartości wyrażeń w eksperymentach można porównać, normalizując je do poziomu wyrażenia tego "standardu".

10. Reprezentatywne wyniki:

Dobra elektroporacja powoduje ekspresję konstruktu DNA na 1/4 do 1/3 powierzchni siatkówki (ryc. 4A). Ponieważ w szczególności fotoreceptory pręcików są skutecznie transdukowane, technika ta jest idealna do ilościowego określania aktywności promotora specyficznego dla fotoreceptorów (ryc. 4B). Wcześniej zastosowaliśmy to podejście do ilościowego określenia szeregu wariantów promotorów z loci¹⁰ Rho i Gnat1 specyficznych dla pręcików. Odkryliśmy, że możliwe jest ilościowe określenie aktywności promotora w prawie 300-krotnym zakresie.

Rysunek 5 to przykładowy zestaw danych z pojedynczej elektroporowanej siatkówki. W tym konkretnym przykładzie eksperymentalny konstrukt pNrl(1.1kb)-DsRed został zmierzony w kanale czerwonym, a konstrukt kontrolny pNrl(3.2kb)-GFP został zmierzony w kanale zielonym. Kompletny zestaw danych dla konstrukcji pNrl(1.1kb)-DsRed składałby się z 6-9 siatkówk zmierzonych w ten sposób, a odchylenie standardowe zostałoby obliczone na podstawie wszystkich wartości "DsRed znormalizowanych do GFP". Gdybyśmy porównywali poziom ekspresji pNrl(1.1kb)-DsRed z, na przykład, pNrl(0.8kb)-DsRed, to oba konstrukty musiałyby zostać elektroporowane tą samą kontrolą GFP (np. pNrl(3.2kb)-GFP) i zobrazowane w tych samych czasach ekspozycji. Możliwe jest łączenie danych zebranych w różnych dniach, jeśli każdego dnia wykonywana jest standardowa elektroporacja DsRed/GFP (np. pNrl(3,2kb)-dsRed + pNrl(3,2kb)-GFP). Dla każdego konstruktu eksperymentalnego znormalizowany poziom DsRed zostałby następnie znormalizowany do znormalizowanego poziomu DsRed "standardu" (pNrl(3.2kb)-dsRed).

Technika, którą tutaj opisujemy, jest przede wszystkim przydatna do ilościowego określania aktywności fotoreceptorów CREs^10,13. Specyficzna dla typu komórki aktywność cis-regulatorowa może być również określona ilościowo w rzadszych typach komórek siatkówki, takich jak komórki dwubiegunowe¹⁴, ale zwykle wymaga to, aby obszary zainteresowania do ilościowego określenia były wybierane w przekrojach pionowych, a nie w preparatach płaskich. To samo dotyczy CRE, które napędzają ekspresję w wielu typach komórek, takich jak fotoreceptory i komórki dwubiegunowe. Poza tym procedury eksperymentalne są podobne.

Rysunek 1. Przegląd procedury elektroporacji eksplantatu siatkówki. Po pierwsze, całe oczy są izolowane od młodych myszy po urodzeniu 0 i siatkówki są preparowane (P1). Po drugie, siatkówki umieszcza się w komorach wypełnionych DNA i poddaje się elektropostacji (P2). Po trzecie, siatkówki umieszcza się na filtrach i hoduje przez osiem dni (P3). Po czwarte, eksplantaty siatkówki są mocowane, montowane na szkiełkach i obrazowane. Intensywność fluorescencji mierzy się za pomocą oprogramowania ImageJ (P4). Po piąte, dane ImageJ są przetwarzane w arkuszu kalkulacyjnym w celu ilościowego określenia różnicy w aktywności różnych promotorów (P5).

Rysunek 2. Budowa czaszy do elektroporacji. A) Niezmodyfikowana komora mikroszkiełkowa firmy Harvard Apparatus, BTX model 453 (katalog #45-0105). B) Narzędzie Dremel służy do odcinania uchwytu od plastikowego stojaka na tuby. Rękojeść pocięta jest na prostokątne przekładki o wymiarach: długość 0,8cm, wysokość 0,6cm, szerokość 0,3cm. C) Przekładki z tworzywa sztucznego są montowane w komorze mikrosuwaka w równych odstępach. Uszczelniacz akwariowy jest wstrzykiwany w szczeliny między przekładkami (nie pokazano). D) Na przekładkach umieszcza się metalowy pręt. E) Pręt i przekładki są mocowane na suwaku za pomocą klipsów do segregatora, aby utrzymać wszystko na miejscu, gdy szczeliwo wysycha przez noc. F) Przekładki są usuwane, a studnie są testowane w celu upewnienia się, że są wodoszczelne. G) Gotowa prowadnica pasuje do plastikowego naczynia z metalowymi prętami przylegającymi do okienka z boku naczynia.

Rysunek 3. Schemat naczynia do elektroporacji z siatkówkami. Komory są wypełnione roztworami DNA (do pięciu różnych roztworów na raz). Siatkówki są umieszczane w komorach i zorientowane tak, aby soczewka opierała się o metalowy pręt połączony z elektrodą dodatnią; Trzy lub cztery siatkówki zmieszczą się w każdej z pięciu komór. Prąd elektryczny spowoduje, że ujemnie naładowane cząsteczki DNA przemieszczą się do komórek siatkówki.

Rysunek 4. A) Pomiar ImageJ poziomu fluorescencji siatkówki w flatmount. Obrazy w skali szarości w kanałach DsRed (eksperymentalne) i GFP (kontrolne) są otwierane w oprogramowaniu ImageJ; Należy pamiętać, że te obrazy zostały pokolorowane wyłącznie w celach ilustracyjnych. Pięć okręgów pomiarowych (od 1 do 5) umieszczono nad równomiernie naelektryzowanymi obszarami, omijając krawędzie i soczewkę (linie przerywane). Trzy okręgi pomiarowe (od 6 do 8) są umieszczone na zewnątrz siatkówki w celu określenia poziomów fluorescencji tła. B) Obrazy przekrojowe elektroporowanego eksplantatu siatkówki o dużej mocy. Eksplant utrwalono w 8 dniu po urodzeniu, kriochroniono w 30% sacharozy/1X PBS przez noc w temperaturze 4°C, osadzono w OCT i poddano kriosekcji w temperaturze 12 μm. Konstrukty fluorescencyjne pNrl(1,1kb)-DsRed i pNrl(3,2kb)-GFP ulegają ekspresji w komórkach fotoreceptorowych w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL). INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; GCL, warstwa komórek zwojowych.

Rysunek 5. Przetwarzanie danych fluorescencyjnych za pomocą programu Excel. W kroku 1 średnia wartość piksela dla każdego okręgu pomiaru jest kopiowana do arkusza kalkulacyjnego (komórki B3-B12, F3-F5, H3-H5). Pomiary #1-5 to wartości siatkówki DsRed, a #6-8 to wartości tła DsRed; Pomiary #9-13 to wartości siatkówki GFP, a #14-16 to wartości tła GFP. Zauważ, że pomiar #1 i #9 odpowiadają temu samemu kręgowi pomiarowemu, podobnie jak pomiary #2 i #10 i tak dalej. W kroku 2 obliczana jest średnia wartość tła dla kanałów DsRed i GFP (komórki F6, H6). W kroku 3 średnie tło jest odejmowane od każdego pomiaru siatkówki (komórki C3-C12). W kroku 4 każdy pomiar DsRed odjęty od tła jest normalizowany do odpowiadającego mu pomiaru GFP (komórki D3-D7).

Nie stwierdzono konfliktu interesów.