Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Podsumowanie

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Streszczenie

Ludzka gruczoł mlekowy składa się z 15-20 płatów, które wydzielają mleko do rozgałęzionego systemu przewodowego otwierającego się w obrębie brodawki. Płaty te składają się z wielu końcowych jednostek przewodowo-płacowych zbudowanych z pęcherzyków wydzielniczych i zbiegających się przewodów¹. U myszy podczas ciąży obserwuje się podobną architekturę, w której przewody i pęcherzyki są rozmieszczone w obrębie zrębu tkanki łącznej. Nabłonek gruczołu mlekowego myszy stanowi drzewiasty system przewodów złożony z dwóch warstw komórek: wewnętrznej warstwy komórek luminalnych otoczonych zewnętrzną warstwą komórek mioepitelialnych, ograniczonych błoną podstawną². W chwili narodzin obecne jest jedynie rudymentarne drzewo przewodowe, składające się z przewodu głównego i 15-20 odgałęzień. Wydłużanie i amplifikacja odgałęzień rozpoczynają się na początku okresu dojrzewania, około 4 tygodnia życia, pod wpływem hormonów^3,4,5. W 10 tygodniu większość zrębu zostaje zainfekowana przez złożony system przewodów, które będą przechodzić cykle rozgałęziania i regresji w każdym cyklu rujowym aż do wystąpienia ciąży². Wraz z początkiem ciąży rozpoczyna się druga faza rozwoju, polegająca na proliferacji i różnicowaniu nabłonka w celu utworzenia przypominających winogrona struktur wydzielniczych mleka, zwanych pęcherzykami^6,7. Po porodzie i w trakcie laktacji mleko jest produkowane przez luminalne komórki wydzielnicze i gromadzone w świetle pęcherzyków. Wydzielanie oksytocyny, stymulowane odruchem nerwowym wywołanym ssaniem młodych, indukuje zsynchronizowane skurcze komórek mioepitelialnych wokół pęcherzyków i wzdłuż przewodów, co umożliwia transport mleka przez przewody do brodawki, gdzie staje się ono dostępne dla młodych ⁸. Rozwój, różnicowanie i funkcja gruczołu mlekowego są ściśle zorganizowane i wymagają nie tylko interakcji między zrębem a nabłonkiem, ale także między komórkami mioepitelialnymi a luminalnymi w obrębie nabłonka^9,10,11. W związku z tym mutacje w wielu genach zaangażowanych w te interakcje mogą upośledzać albo wydłużanie przewodów podczas dojrzewania, albo tworzenie pęcherzyków we wczesnej ciąży, różnicowanie w późnej ciąży oraz aktywację wydzielniczą prowadzącą do laktacji^12,13. W niniejszym artykule opisujemy, jak przeprowadzić sekcję gruczołów mlekowych myszy i ocenić ich rozwój przy użyciu preparatów całych organów (whole mounts). Demonstrujemy również, jak ocenić skurcze mioepitelialne i wydzielanie mleka za pomocą funkcjonalnego testu ex-vivo opartego na oksytocynie. W ten sposób, wykonując te dwie techniki u myszy mutantów i kontrolnych myszy typu dzikiego, można określić wpływ mutacji genowej na rozwój i funkcję gruczołu mlekowego in situ.

Protokół

1. Disekcja gruczołu mlekowego

1. Uśmierć mysz poprzez inhalację CO₂. Jeśli to możliwe, unikaj zwichnięcia stawów szyjnych, ponieważ może ono uszkodzić główne naczynia krwionośne w szyi i doprowadzić do nagromadzenia krwi wokół gruczołów mlekowych, co utrudni sekcję.
2. Na styropianie owiniętym folią ułóż mysz na grzbiecie i rozstaw cztery kończyny. Mocno przymocuj wszystkie cztery kończyny za pomocą igieł o rozmiarze 16-20 G (Rycina 1A).
3. Obficie spryskaj mysz 70% etanolem.
4. Za pomocą pęsety unieś skórę brzucha wzdłuż linii środkowej i wykonaj niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami.
5. Zaczynając od nacięcia, rozetnij skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jam brzusznej lub klatki piersiowej (Rycina 1B).
6. Rozetnij skórę na przednich łapach do nacięcia w linii środkowej, tworząc „kształt Y” (Rycina 1B). W ten sam sposób rozetnij skórę na tylnych kończynach (Rycina 1B).
7. Za pomocą kleszczyków hemostatycznych ostrożnie odsunij skórę brzucha i klatki piersiowej na bok myszy. W razie potrzeby delikatnie przetnij tkankę łączną.
8. Przymocuj skórę do styropianu za pomocą igieł o rozmiarze 16-20 G, odsłaniając gruczoły mlekowe przymocowane do wewnętrznej strony skóry. Pracuj po kolei, kończąc jedną stronę przed przejściem do drugiej (Rycina 1C).
9. Za pomocą pęsety ostrożnie unieś interesujący Cię gruczoł mlekowy i przetnij tkankę między gruczołem a skórą małymi, ostrymi nożyczkami, zaczynając od zewnątrz w kierunku kręgosłupa zwierzęcia. Pamiętaj o dokładnym cięciu, aby na gruczole nie pozostały fragmenty skóry lub mięśni. Wszystkie gruczoły mlekowe (Rycina 1) można usunąć za pomocą tego protokołu, jednak gruczoły brzuszne (#4) są najlepsze do preparatów całych (whole mounting). 2^nd i 3^rd gruczoł zawierają przeplatające się mięśnie i choć mogą być stosowane do preparatów całych oraz histologii, mogą nie być odpowiednie do wszystkich analiz.

2. Preparat całego organizmu

1. Przynajmniej jeden dzień przed sekcją przygotować roztwór karminu z ałunem, rozpuszczając 1 g karminu i 2,5 g siarczanu glinowo-potasowego w 500 ml wody destylowanej, a następnie gotować przez 20 minut w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 litra. Uzupełnić objętość wodą do 500 ml. Przefiltrować przez papier Whatmana i dodać niewielką ilość tymolu (kilka ziaren) jako konserwant. Przechowywać w lodówce. Po barwieniu roztwór karminu z ałunem można przelać z powrotem do butelki z zapasem i używać wielokrotnie przez kilka tygodni. Przygotować świeży roztwór, gdy kolor stanie się blady.
2. Po wycięciu gruczołu mlekowego z myszy (krok 1), rozłożyć go bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Należy starać się spłaszczyć go jak najmocniej, zachowując oryginalny kształt in situ. Gruczoł będzie dobrze przylegać do szkiełka, jeśli zostanie odpowiednio rozciągnięty.
3. Utrwalić gruczoł, zanurzając go wraz ze szkiełkiem w utrwalaczu Carnoya (100% EtOH, chloroform, lodowaty kwas octowy; 6:3:1) na 4 godziny w słoiku, w dygestorium w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że inni autorzy stosowali czas 2 godziny, co wydaje się być wystarczające. Alternatywnie gruczoły można utrwalać w temperaturze 4°C przez noc.
4. Przemyć w 70% etanolu przez 15 min. Następnie stopniowo nawodnić w wodzie, usuwając połowę roztworu etanolu ze słoika i zastępując go ddH₂O. Inkubować przez 5 min. Powtórzyć 3 razy. Alternatywnie można zastosować kąpiele w etanolu o stężeniach 70%, 35%, 15% oraz w wodzie przez 5 minut każda.
5. Płukać w wodzie destylowanej przez 5 minut.
6. Barwić karminem z ałunem przez noc w temperaturze pokojowej. Należy zaznaczyć, że barwienie może trwać dłużej w zależności od grubości gruczołu.
7. Usunąć barwnik karmin z ałunem w celu ponownego użycia i stopniowo odwodnić zabarwioną tkankę w seryjnych kąpielach etanolowych (50%, 70%, 95%, 100%) przez 5 min każda, a następnie przejaśnić w ksylenie lub w nietoksycznej alternatywie, takiej jak Histo-clear, przez noc. Zarówno odwadnianie, jak i przejaśnianie mogą wymagać dłuższych inkubacji w przypadku grubszych próbek.
8. Zanurzyć gruczoł mlekowy w salicylanie metylu. Gruczoły mleczne mogą być przechowywane w salicylanie metylu w dygestorium do momentu wykonania zdjęć.
9. Zdjęcia można wykonać w dygestorium za pomocą zwykłego aparatu cyfrowego ustawionego na statywie (używając funkcji „makro”, jeśli jest dostępna), kładąc szkiełka na stole świetlnym. Do większych powiększeń należy użyć mikroskopu stereoskopowego. Alternatywnie gruczoły mleczne można zamontować w mediach takich jak Permount (po kroku 2.7), co umożliwia wykonywanie zdjęć poza dygestorium chemicznym na dowolnej platformie obrazowania, pod warunkiem, że preparaty są wystarczająco cienkie.
10. W celu ilościowej oceny rozwoju gruczołu mlekowego w preparacie całego narządu (whole mount), można ocenić takie parametry jak liczba rozgałęzień (lub odgałęzień bocznych) wzdłuż odcinków przewodów, długość przewodów głównych lub stosunek powierzchni tkanki nabłonkowej do tkanki tłuszczowej. Ostatecznie, po dokumentacji fotograficznej, preparat całego gruczołu mlekowego można zalać parafiną w celu wykonania skrawków i konwencjonalnego barwienia histologicznego.

3. Wyrzut mleka indukowany oksytocyną

1. Oddziel szczenięta od matki bezpośrednio po ich nakarmieniu. Odczekaj 1 godzinę przed przeprowadzeniem testu.
2. Uśmierć matkę i odsłoń gruczoły mlekowe zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 1.1 do 1.8), nie usuwając ich z organizmu zwierzęcia.
3. Rozpocznij test, równomiernie nanieosząc PBS lub roztwór oksytocyny bezpośrednio na badany gruczoł mlekowy za pomocą pipety transferowej. Można zastosować szerokie spektrum dawek; zazwyczaj stosuje się ˜8 pg/ml (dawka fizjologiczna). Jednakże, w celu potwierdzenia braku odpowiedzi w zmodyfikowanych genetycznie modelach mysich, można zastosować wysokie dawki niefizjologiczne (do 1 mg/ml). W tej procedurze zaleca się użycie gruczołów piersiowych (#2-3), wykorzystując jedną stronę jako kontrolę (eksponowaną na PBS), a drugą do badania wyrzutu mleka (eksponowaną na oksytocynę).
4. Inkubuj przez 1 minutę, a następnie usuń roztwór, ostrożnie go odsysając pipetą transferową. Napływ mleka do przewodów można monitorować za pomocą nagrania wideo lub wykonując zdjęcia przed i po ekspozycji na PBS lub oksytocynę.

4. Reprezentatywne wyniki:

W prawidłowo przygotowanym preparacie całego narządu gruczoł mlekowy jest odpowiednio rozpostarty, a przewody nabłonkowe są łatwo dostrzegalne (Rycina 2A). Jeśli gruczoł nie zostanie odpowiednio rozpostarty, może on częściowo lub całkowicie oderwać się od szkiełka podczas umieszczenia w roztworze utrwalającym. W takim przypadku gruczoł staje się twardy i niezdatny do dalszej analizy (Rycina 2B). Podobnie, jeśli preparat nie zostanie starannie wypreparowany, może dojść do ubytku fragmentów nabłonka (Rycina 2C) lub pozostałości skóry bądź mięśni brzucha mogą utrudniać analizę gruczołu (Rycina 2D).

W przypadku oznaczenia oksytocyny ważne jest, aby oddzielać ssące szczenięta od matki przez ten sam przedział czasu przy każdej okazji. W ten sposób zapewnią Państwo, że w przewodach przed ekspozycją na oksytocynę nie będzie obecne mleko lub jego niewielkie ilości, a jednocześnie w pęcherzykach mlecznych znajdzie się wystarczająca ilość mleka, która może zostać wyrzucona do przewodów wskutek skurczów komórek mioepitelialnych (Rycina 3A). Jeśli szczenięta zostaną usunięte zbyt wcześnie, mleko może nagromadzić się w pęcherzykach i przewodach, co utrudni monitorowanie efektu działania oksytocyny (Rycina 3B). Z kolei jeśli eksperyment zostanie przeprowadzony zbyt wcześnie po usunięciu szczeniąt, mleko nie zdąży nagromadzić się w pęcherzykach, a wywołane oksytocyną skurcze komórek mioepitelialnych nie spowodują uwolnienia do przewodów ilości mleka wystarczającej do zaobserwowania (Rycina 3C).

Rycina 1. Disekcja gruczołów mlekowych myszy. Przypnij mysz na grzbiecie za pomocą czterech kończyn (A). Przetnij skórę najpierw od brzucha do szyi. Następnie wykonaj nacięcia prostopadłe od środka brzucha do każdej kończyny, zgodnie z linią przerywaną (B). Delikatnie odsunie skórę na boki ciała zwierzęcia i przypnij ją, odsłaniając gruczoły mlekowe (C).

Rycina 2. Preparat całego gruczołu mlekowego myszy. Przewody nabłonka (strzałki) oraz węzeł chłonny (grot strzałki) są wyraźnie widoczne w dobrze rozprowadzonej preparacji całego gruczołu mlekowego nr 4 (A). Słabo rozprowadzony gruczoł mlekowy może oddzielić się od szkiełka i ulec zapadnięciu, co czyni go niezdatnym do użycia (B). Nieprawidłowo wycięty gruczoł mlekowy może mieć brakujące fragmenty (C) lub pozostałości mięśni bądź skóry (D). Należy zauważyć, że 2^nd i 3^rd gruczoły posiadają przeplatające się włókna mięśniowe, ale nadal mogą być wykorzystane do preparacji całego narządu lub badań histologicznych.

Rysunek 3. Wypływ mleka indukowany oksytocyną można zaobserwować w przewodach nabłonkowych (strzałki) po ekspozycji na oksytocynę (A). Jeśli jednak na początku badania przewody są już wypełnione mlekiem (strzałki) z powodu niewłaściwie długiego okresu latencji po ostatnim ssaniu przez szczenięta, dalsza akumulacja mleka w przewodach (strzałki) po ekspozycji na oksytocynę jest trudna do zaobserwowania (B). Z kolei krótki okres latencji po ssaniu przez szczenięta nie pozwoli na wystarczającą akumulację mleka w pęcherzykach, aby można było ją prawidłowo zaobserwować w przewodach (strzałki) po ekspozycji na oksytocynę (C). Obrazy wykonano przed i po ekspozycji na oksytocynę przy użyciu aparatu cyfrowego (Cybershot, Sony).

Rycina 4. Schematy przygotowania preparatów całych oraz testów z zastosowaniem oksytocyny.

Dyskusja

Rozwój i funkcja gruczołu mlekowego są ściśle skoordynowane. Myszy mutanty mogą posiadać mutacje genowe, które upośledzają rozwój i funkcję gruczołu mlekowego, co podkreśla konieczność oceny architektury gruczołu^13,12. Przygotowanie preparatów całych gruczołów (whole mounting), zgodnie z opisem w niniejszym artykule, można przeprowadzać na wszystkich etapach rozwoju gruczołu mlekowego. Zazwyczaj rozwój nabłonka ocenia się na początku okresu dojrzewania (˜4 tydzień życia), w połowie okresu dojrzewania (˜6 tydzi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Karmin	Sigma-Aldrich	C1022
Siarczan glinowo-potasowy	Sigma-Aldrich	A6435
Tymol	Sigma-Aldrich	T0501
Salicylan metylu	Sigma-Aldrich	M6752
Oksytocyna	Sigma-Aldrich	O3251