Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Podsumowanie

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Streszczenie

Ludzka gruczoł mlekowy składa się z 15-20 płatów, które wydzielają mleko do rozgałęzionego systemu przewodowego otwierającego się w obrębie brodawki. Płaty te składają się z wielu końcowych jednostek przewodowo-płacowych zbudowanych z pęcherzyków wydzielniczych i zbiegających się przewodów¹. U myszy podczas ciąży obserwuje się podobną architekturę, w której przewody i pęcherzyki są rozmieszczone w obrębie zrębu tkanki łącznej. Nabłonek gruczołu mlekowego myszy stanowi drzewiasty system przewodów złożony z dwóch warstw komórek: wewnętrznej warstwy komórek luminalnych otoczonych zewnętrzną warstwą komórek mioepitelialnych, ograniczonych błoną podstawną². W chwili narodzin obecne jest jedynie rudymentarne drzewo przewodowe, składające się z przewodu głównego i 15-20 odgałęzień. Wydłużanie i amplifikacja odgałęzień rozpoczynają się na początku okresu dojrzewania, około 4 tygodnia życia, pod wpływem hormonów^3,4,5. W 10 tygodniu większość zrębu zostaje zainfekowana przez złożony system przewodów, które będą przechodzić cykle rozgałęziania i regresji w każdym cyklu rujowym aż do wystąpienia ciąży². Wraz z początkiem ciąży rozpoczyna się druga faza rozwoju, polegająca na proliferacji i różnicowaniu nabłonka w celu utworzenia przypominających winogrona struktur wydzielniczych mleka, zwanych pęcherzykami^6,7. Po porodzie i w trakcie laktacji mleko jest produkowane przez luminalne komórki wydzielnicze i gromadzone w świetle pęcherzyków. Wydzielanie oksytocyny, stymulowane odruchem nerwowym wywołanym ssaniem młodych, indukuje zsynchronizowane skurcze komórek mioepitelialnych wokół pęcherzyków i wzdłuż przewodów, co umożliwia transport mleka przez przewody do brodawki, gdzie staje się ono dostępne dla młodych ⁸. Rozwój, różnicowanie i funkcja gruczołu mlekowego są ściśle zorganizowane i wymagają nie tylko interakcji między zrębem a nabłonkiem, ale także między komórkami mioepitelialnymi a luminalnymi w obrębie nabłonka^9,10,11. W związku z tym mutacje w wielu genach zaangażowanych w te interakcje mogą upośledzać albo wydłużanie przewodów podczas dojrzewania, albo tworzenie pęcherzyków we wczesnej ciąży, różnicowanie w późnej ciąży oraz aktywację wydzielniczą prowadzącą do laktacji^12,13. W niniejszym artykule opisujemy, jak przeprowadzić sekcję gruczołów mlekowych myszy i ocenić ich rozwój przy użyciu preparatów całych organów (whole mounts). Demonstrujemy również, jak ocenić skurcze mioepitelialne i wydzielanie mleka za pomocą funkcjonalnego testu ex-vivo opartego na oksytocynie. W ten sposób, wykonując te dwie techniki u myszy mutantów i kontrolnych myszy typu dzikiego, można określić wpływ mutacji genowej na rozwój i funkcję gruczołu mlekowego in situ.

Protokół

1. Disekcja gruczołu mlekowego

1. Uśmierć mysz poprzez inhalację CO₂. Jeśli to możliwe, unikaj dyslokacji szyi, ponieważ może ona uszkodzić główne naczynia krwionośne w szyi i doprowadzić do gromadzenia się krwi wokół gruczołów mlekowych, co utrudni sekcję.
2. Na styropianie owiniętym folią ułóż mysz na grzbiecie i rozszerz cztery kończyny. Mocno przypnij wszystkie cztery kończyny, używając igieł o rozmiarze od 16 do 20 G (Rysunek 1A).
3. Obficie spryskaj mysz 70% etanolem.
4. Za pomocą pęsety odciągnij skórę brzucha wzdłuż linii środkowej i wykonaj niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami.
5. Rozpocznij od nacięcia i rozetnij skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jam brzusznej lub klatki piersiowej (Rysunek 1B).
6. Rodetnij skórę na przednich kończynach do nacięcia w linii środkowej, tworząc kształt litery „Y” (Rysunek 1B). W ten sam sposób rozetnij skórę na tylnych kończynach (Rysunek 1B).
7. Za pomocą kleszczyków hemostatycznych delikatnie odsuń skórę brzucha i klatki piersiowej na bok myszy. W razie potrzeby delikatnie przetnij tkankę łączną.
8. Przymocuj skórę do styropianu za pomocą igieł o rozmiarze od 16 do 20 G, odsłaniając gruczoły mleczne przyczepione do wewnętrznej strony skóry. Wykonaj tę czynność dla jednej strony, a następnie dla drugiej (Rysunek 1C).
9. Za pomocą pęsety delikatnie unieś interesujący Cię gruczoł mleczny i rozetnij tkankę między gruczołem a skórą małymi ostrymi nożyczkami, zaczynając od zewnątrz w stronę kręgosłupa zwierzęcia. Pamiętaj, aby ciąć ostrożnie, tak aby na gruczole nie pozostały fragmenty skóry ani mięśni. Wszystkie gruczoły mleczne (Rysunek 1) można usunąć zgodnie z tym protokołem, jednak gruczoły brzuszne (#4) są najlepsze do preparatów całych (whole mount). Gruczoły 2^nd i 3^rd posiadają niektóre mięśnie przeplatające i choć mogą być użyte do preparatów całych oraz histologii, mogą nie być odpowiednie do wszystkich rodzajów analiz.

2. Preparat całego organizmu

1. Przynajmniej jeden dzień przed sekcją przygotować roztwór karminu z ałunem, rozpuszczając 1g karminu i 2,5g siarczanu glino-potasowego w 500 ml wody destylowanej, a następnie gotując przez 20 minut w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 litra. Uzupełnić końcową objętość do 500 ml wodą. Przefiltrować przez papier Whatmana i dodać niewielką ilość tymolu (kilka ziaren) jako konserwant. Przechowywać w lodówce. Po barwieniu roztwór karminu z ałunem można przelać z powrotem do butelki z zapasem i używać wielokrotnie przez kilka tygodni. Przygotować świeży roztwór, gdy kolor stanie się blady.
2. Po wycięciu gruczołu mlekowego z myszy (krok 1), rozłożyć go bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Należy starać się go maksymalnie spłaszczyć, zachowując oryginalny kształt in situ. Prawidłowo rozciągnięty gruczoł będzie dobrze przylegać do szkiełka.
3. Utrwalić gruczoł, zanurzając go wraz ze szkiełkiem w utrwalaczu Carnoya (100% EtOH, chloroform, lodowaty kwas octowy; 6:3:1) na 4 godziny w słoiku w dygestorium w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że inni stosowali czas 2 godziny, co wydaje się być wystarczające. Alternatywnie, gruczoły można utrwalać przez noc w temperaturze 4°C.
4. Przemyć w 70% etanolu przez 15 min. Następnie stopniowo rehydratyzować w wodzie, usuwając połowę roztworu etanolu ze słoika i zastępując ją ddH₂O. Inkubować przez 5 min. Powtórzyć 3 razy. Alternatywnie można zastosować kąpiele w etanolu o stężeniach 70%, 35%, 15% oraz w wodzie przez 5 minut każda.
5. Płukać w wodzie destylowanej przez 5 minut.
6. Barwić karminem z ałunem przez noc w temperaturze pokojowej. Należy zaznaczyć, że barwienie może trwać dłużej w zależności od grubości gruczołu.
7. Usunąć barwnik karmin z ałunem do ponownego wykorzystania i stopniowo odwodnić zabarwoną tkankę w seryjnych kąpielach etanolowych (50%, 70%, 95%, 100%) po 5 min każda, a następnie przejrzyścić w ksylenie lub w nietoksycznej alternatywie, takiej jak Histo-clear, przez noc. Zarówno odwadnianie, jak i przejrzyszczanie mogą wymagać dłuższej inkubacji w przypadku grubszych próbek.
8. Zanurzyć gruczoł mlekowy w salicylanie metylu. Gruczoły mlekowe można przechowywać w salicylanie metylu w dygestorium do czasu wykonania zdjęć.
9. Zdjęcia można wykonać w dygestorium za pomocą zwykłego aparatu cyfrowego umieszczonego na statywie (używając funkcji „makro”, jeśli jest dostępna), kładąc szkiełka na stole świetlnym. Do większych powiększeń należy użyć mikroskopu stereotypowego. Alternatywnie, gruczoły mlekowe można zamknąć w medium, takim jak Permount (po kroku 2.7), co umożliwia wykonywanie zdjęć poza dygestorium chemicznym na dowolnej platformie obrazującej, pod warunkiem, że preparaty są wystarczająco cienkie.
10. W celu ilościowej oceny rozwoju gruczołu mlekowego z wykorzystaniem preparatów całych (whole mount), można ocenić takie parametry jak liczba rozgałęzień (lub odgałęzień bocznych) wzdłuż fragmentów przewodów, długość przewodów głównych lub stosunek powierzchni tkanki nabłonkowej do tłuszczowej. Na koniec, po dokumentacji fotograficznej, cały preparat gruczołu mlekowego można zalać parafiną w celu wykonania skrawków i konwencjonalnego barwienia histologicznego.

3. Wypływ mleka indukowany oksytocyną

1. Oddziel szczenięta od matki bezpośrednio po ich nakarmieniu. Odczekaj 1 godzinę przed przeprowadzeniem testu.
2. Uśmierć matkę i odsłoń gruczoły mlekowe zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 1.1 do 1.8), nie usuwając ich z organizmu zwierzęcia.
3. Rozpocznij test, nakraplając równomiernie PBS lub roztwór oksytocyny bezpośrednio na badany gruczoł mlekowy za pomocą pipety transferowej. Można zastosować szerokie spektrum dawek; zazwyczaj stosuje się ˜8 pg/ml (dawka fizjologiczna). Jednakże, w celu upewnienia się co do braku reakcji w genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich, można zastosować wysokie dawki niefizjologiczne (do 1 mg/ml). W tej procedurze zaleca się stosowanie gruczołów piersiowych (#2-3), wykorzystując jedną stronę jako kontrolę (ekspozycja na PBS), a drugą stronę do testowania wydzielania mleka (ekspozycja na oksytocynę).
4. Inkubuj przez 1 minutę, a następnie usuń roztwór, ostrożnie odsysając go pipetą transferową. Napływ mleka do przewodów można monitorować za pomocą rejestracji wideo lub wykonując zdjęcia przed i po ekspozycji na PBS lub oksytocynę.

4. Reprezentatywne wyniki:

W prawidłowo przygotowanym preparacie całego narządu gruczoł mlekowy jest dobrze rozpostarty, a przewody nabłonkowe są łatwo widoczne (Rycina 2A). Jeśli gruczoł nie jest odpowiednio rozpostarty, po umieszczeniu w roztworze fixatywnym może częściowo lub całkowicie oddzielić się od szkiełka. Wówczas gruczoł stwardnieje i stanie się niezdatny do użycia (Rycina 2B). Podobnie, jeśli preparat nie został odpowiednio wypreparowany, część nabłonka może być nieobecna (Rycina 2C) lub pozostałości skóry bądź mięśni brzusznych mogą utrudniać analizę gruczołu (Rycina 2D).

W przypadku badania oksytocyny ważne jest, aby za każdym razem oddzielać ssące młode od matki na taki sam czas. W ten sposób zapewnią Państwo, że przed ekspozycją na oksytocynę w przewodach nie będzie znajdować się mleko lub jego niewielkie ilości, a jednocześnie w pęcherzykach mlecznych zgromadzi się wystarczająca ilość mleka, która będzie mogła zostać wpompowana do przewodów pod wpływem skurczów komórek mojepithelialnych (Rysunek 3A). Jeśli młode zostaną usunięte zbyt wcześnie, mleko może gromadzić się w pęcherzykach i przewodach, co utrudni monitorowanie efektu działania oksytocyny (Rysunek 3B). Z kolei jeśli eksperyment zostanie przeprowadzony zbyt szybko po usunięciu młodych, mleko nie zdąży zgromadzić się w pęcherzykach, a wywołane oksytocyną skurcze komórek mojepithelialnych nie spowodują uwalniania do przewodów ilości mleka wystarczającej do zaobserwowania (Rysunek 3C).

Rysunek 1. Disekcja gruczołów mlekowych myszy. Przymocuj mysz do podłoża na grzbiecie, przypinając cztery kończyny (A). Najpierw przetnij skórę od brzucha w kierunku szyi. Następnie wykonaj nacięcia prostopadłe od środka brzucha do każdej kończyny, zgodnie z linią przerywaną (B). Delikatnie odchyl skórę na boki i przypnij ją, odsłaniając gruczoły mlekowe (C).

Rysunek 2. Preparat całego gruczołu mlekowego myszy. Przewody nabłonkowe (strzałki) oraz węzeł chłonny (grot strzałki) są wyraźnie widoczne w dobrze rozłożonym preparacie całego gruczołu mlekowego nr 4 (A). Słabo rozłożony gruczoł mlekowy może odkleić się od szkiełka i zapaść, co czyni go niezdatnym do użytku (B). Nieprawidłowo wycięty gruczoł mlekowy może mieć brakujące części (C) lub pozostałości mięśni lub skóry (D). Należy zauważyć, że 2^gi i 3^ci gruczoły posiadają przeplatające się mięśnie, ale nadal mogą być wykorzystane do preparatów całych lub badań histologicznych.

Rycina 3. Wypływ mleka indukowany oksytocyną można zaobserwować w przewodach nabłonkowych (strzałki) po podaniu oksytocyny (A). Jednakże, jeśli na początku badania przewody są już wypełnione mlekiem (strzałki) z powodu zbyt długiego okresu latencji po ostatnim ssaniu przez szczenięta, dalsza akumulacja mleka w przewodach (strzałki) po podaniu oksytocyny jest trudna do zaobserwowania (B). Z kolei krótki okres latencji po ssaniu przez szczenięta nie pozwoli na wystarczającą akumulację mleka w pęcherzykach, aby można go było prawidłowo zaobserwować w przewodach (strzałki) po podaniu oksytocyny (C). Obrazy wykonano przed i po podaniu oksytocyny przy użyciu aparatu cyfrowego (Cybershot, Sony).

Rycina 4. Schematyczne przedstawienie preparowania całych organizmów oraz testów z zastosowaniem oksytocyny.

Dyskusja

Rozwój i funkcja gruczołu mlekowego są ściśle skoordynowane. Myszy mutanty mogą posiadać mutacje genowe, które upośledzają rozwój i funkcję gruczołu mlekowego, co podkreśla konieczność oceny architektury gruczołu^13,12. Przygotowanie preparatów całych gruczołów (whole mounting), zgodnie z opisem w niniejszym artykule, można przeprowadzać na wszystkich etapach rozwoju gruczołu mlekowego. Zazwyczaj rozwój nabłonka ocenia się na początku okresu dojrzewania (˜4 tydzień życia), w połowie okresu dojrzewania (˜6 tydzi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Karmin	Sigma-Aldrich	C1022
Siarczan glinowo-potasowy	Sigma-Aldrich	A6435
Tymol	Sigma-Aldrich	T0501
Salicylan metylu	Sigma-Aldrich	M6752
Oksytocyna	Sigma-Aldrich	O3251