Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami z zakażeniem HIV

Podsumowanie

Nasz eksperyment pokaże, jak przeprowadzić analizę sekwencjonowania gatunków bakterii translokujących do krwi obwodowej pacjentów z dodatnim wynikiem testu na HIV.

Streszczenie

Zdrowy przewód pokarmowy jest fizjologicznie kolonizowany przez szeroką gamę drobnoustrojów komensalnych, które wpływają na rozwój humoralnego i komórkowego układu odporności śluzówkowej^1,2.

Mikrobiota jest chroniona przed układem odpornościowym przez silną barierę śluzową. Wiadomo, że infekcje i antybiotyki zmieniają zarówno naturalną barierę przewodu pokarmowego, jak i skład bakterii rezydentnych, co może prowadzić do możliwych nieprawidłowości immunologicznych³.

HIV powoduje naruszenie bariery żołądkowo-jelitowej z postępującym upośledzeniem odporności śluzówkowej oraz przedostawaniem się do krążenia systemowego produktów bakteryjnych, takich jak lipopolisacharydy i fragmenty bakteryjnego DNA, co przyczynia się do systemowej aktywacji immunologicznej^4-7. Translokacja drobnoustrojów jest zaangażowana w immunopatogenezę HIV/AIDS oraz w odpowiedź na terapię ^4,8.

Naszym celem była charakterystyka składu bakterii translokujących do krwi obwodowej u pacjentów zakażonych HIV. Aby zrealizować ten cel, przeprowadziliśmy reakcję PCR dla panbakteryjnego genu 16S rRNA, a następnie wykonaliśmy analizę sekwencjonowania.

W skrócie, wykorzystywana jest krew pełna pobrana zarówno od osób zakażonych HIV, jak i od osób zdrowych. Biorąc pod uwagę, że u osób zdrowych występuje prawidłowa homeostaza jelitowa, u tych pacjentów nie spodziewa się translokacji mikroflory. Po pobraniu krwi pełnej drogą wenerpunkcji i oddzieleniu osocza, z osocza ekstrahuje się DNA, które jest następnie wykorzystywane do reakcji PCR o szerokim zakresie dla panbakteryjnego genu rybosomalnego 16S⁹. Po puryfikacji produktu PCR przeprowadzane są analizy klonowania i sekwencjonowania.

Protokół

Praca z próbkami krwi zakażonej HIV wymaga przestrzegania kilku istotnych zaleceń.
Wszystkie próbki krwi muszą być transportowane w wytrzymałych, szczelnych pojemnikach. Podczas pobierania próbek należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia zewnętrznej strony pojemnika oraz jakiejkolwiek dokumentacji towarzyszącej próbce.
Wszystkie osoby przetwarzające zakażoną krew muszą nosić rękawiczki. Rękawiczki należy zmienić, a ręce umyć po zakończeniu obróbki próbek.
Obróbka próbek krwi zakażonej HIV musi być przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II (biohazard cabinet hood).
Należy stosować mechaniczne wspomagacze do pipetowania.
Stosowanie igieł lub innych ostrych narzędzi (w tym szkła, np. pipet lub kapilar) musi być ograniczone do sytuacji, w których nie ma alternatywy.
Powierzchnie laboratoryjne muszą być odkażone odpowiednim chemicznym środkiem dezynfekcyjnym po rozlaniu krwi oraz po zakończeniu prac.
Użyte materiały zanieczyszczone muszą zostać odkażone przed ponownym użyciem lub prawidłowo zutylizowane jako odpady kliniczne.
Każdy przypadek narażenia zawodowego na potencjalnie zakażoną krew lub płyny (tj. takie, które wymagają stosowania środków ostrożności uniwersalnych) należy traktować jako nagły wypadek medyczny, ponieważ interwencje muszą zostać podjęte bezzwłocznie, aby były skuteczne.
Realizacja protokołu trwa 5 dni. Harmonogram czasowy przedstawiono na Rysunku 1.
Gatunki bakterii są identyfikowane przy użyciu metod opisanych na Rysunku 2.

1. Pobieranie próbek

1. Do probówek zawierających EDTA pobiera się 9 ml krwi pełnej.
2. Probówki wiruje się przy 2000 rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osocza.
3. Osocze przenosi się do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml.

2. Ekstrakcja DNA z próbek plazmy

1. Odpowiednio zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza, pipety oraz materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu, aby zagwarantować sterylność.
2. Umieścić wszystkie materiały pod lampami UV na co najmniej 30 minut.
3. Przetrzeć rękawiczki środkiem dezynfekującym.
4. Nasączyć kilka ręczników papierowych etanolem i umieścić je w komorze. Po każdym wyrzuceniu końcówki przetrzeć pipetę mokrymi ręcznikami papierowymi.

DNA jest ekstrahowany przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (Easy-DNA Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).

5. 350 μL osocza przenosi się do sterylnej probówki typu Eppendorf o pojemności 2 ml.
6. 350 μL przefiltrowanej wody ultrapurej stosuje się jako kontrolę negatywną.
7. Do próbek dodaje się 10 μL lizozymu (1 mg/ml).
8. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.
9. Do próbek dodaje się 500 μL roztworu lizującego (Lysis Solution) i delikatnie miesza.
10. Inkubować przez 7 minut w temperaturze 65°C.
11. Do próbek dodaje się 900 μL chloroformu.
12. Mieszać intensywnie w wortexie, aż próbki osiągną jednolitą lepkość.
13. Dodać 200 μL roztworu wytrącania (Precipitation Solution) i mieszać intensywnie w wortexie.
14. Wirować próbki przy 10500 rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu rozdzielenia faz i utworzenia interfazy.
15. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirowania zawierającej 1 ml 100% etanolu.
16. Wirować próbki przy 10500 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C.
17. Usunąć etanol.
18. Dodać 1 ml 70% etanolu.
19. Wirować próbki z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4°C.
20. Usunąć etanol. Pozostały etanol należy usunąć za pomocą pipety.
21. Resuspender osad w 50 μL wody ultrapurej.
22. Odczytać stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.

3. PCR genu 16S rRNA

Amplifikację PCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem ⁹.

1. Przeprowadzić amplifikację DNA w 100 μL mieszaninie reakcyjnej składającej się z 10 μL buforu PCR 10X, 5 μL 25 mM MgCl2, 5 μL 2 mM całkowitych dNTP, 1 μL 50 μM primera RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 μL 50 μM primera DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 μL H20 oraz 0,5 μL polimerazy Taq (AmpliTaq Gold, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA).
2. Przenieść mieszaninę PCR do filtrów, aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia bakteryjną polimerazą Taq.
3. Odwirować filtry (Microcon, Millipore, Billerica, MA, USA) przez 30 minut przy 500 rcf w temperaturze 4°C.
4. Rozdzielić mieszaninę PCR na aliquoty zgodnie z liczbą próbek wymagających amplifikacji (pozytywne i negatywne kontrole PCR, próbki oraz ekstrahowana woda).
5. Zastosować następujące warunki termocyklera: 94°C przez 10 minut; 40 cykli obejmujących po 1 minucie w 94°C, 55°C i 72°C, oraz 10 min w 72°C.
6. Wizualizować produkt PCR na 2% żelu agarozowym. Użyć markera DNA 100 bp. Rozmiar produktu PCR wynosi około 360 bp (Rysunek 3).

4. Oczyszczanie produktów PCR

Należy oczyścić wyłącznie próbki z wynikiem dodatnim w reakcji PCR. Oczyszczanie przeprowadza się przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcją producenta (PureLink PCR microkit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).

1. Do 1 objętości produktu PCR dodać 4 objętości buforu wiążącego (Binding Buffer) zawierającego izopropanol.
2. Przenieść produkt PCR z buforem wiążącym do kolumny.
3. Wirować przez 1 minutę przy 10000 rcf w temperaturze pokojowej (RT).
4. Przemyć kolumnę buforem płuczącym (Wash Buffer) zawierającym etanol.
5. Wirować przez 1 minutę przy 10000 rcf w temperaturze pokojowej (RT).
6. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), aby osuszyć membranę krzemionkową i usunąć resztki buforu płuczącego z etanolem.
7. Dodać 10 μL wody ultrapure.
8. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
9. Wirować z maksymalną prędkością przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT), aby zebrać oczyszczone DNA.

5. Klonowanie

Przygotowanie płytek z pożywką LB (Lysogeny Broth)

1. Rozpuścić 25 gr mieszanki LB w około 800 ml wody.
2. Dopełnić objętość końcową do 1 L.
3. Dodać 15 gr Bactoagar.
4. Autoklawować przez 20 minut.
5. Po autoklawowaniu energicznie zamieszać roztwór w kolbie, aby wymieszać roztopiony agar.
6. Schłodzić roztwór do 50°C.
7. Dodać ampicylinę (50 μg/ml) i mieszać do czasu rozpuszczenia.
8. Wylać na płytki warstwę o grubości około 3mm.
9. Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej.
10. Nanieść X-Gal (40mg/ml) i IPTG (100 mM) na każdą płytkę LB i inkubować w temperaturze 37°C do momentu użycia.

Transformacja komórek kompetentnych

Transformację przeprowadza się przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (Topo TA cloning kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).

1. Przygotować mieszaninę do reakcji klonowania (1-4 μL świeżego produktu PCR, 1 μL roztworu soli, 1 μL wektora oraz wodę, jeśli jest to konieczne).
2. Delikatnie wymieszać reakcję i inkubować przez 5-10 minut w RT.
3. Umieścić reakcję na lodzie.
4. Dodać 2 μL mieszaniny reakcyjnej do fiolki z kompetentnymi komórkami i delikatnie wymieszać.
5. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
6. Przeprowadzić szok termiczny komórek przez 30 sekund w 42°C.
7. Natychmiast przenieść probówkę na lód.
8. Dodać 250 μL pożywki.
9. Szczelnie zamknąć probówkę i wstrząsać poziomo w 37°C przez 1 godzinę.
10. Wysiać 50 μL z każdej transformacji na uprzednio ogrzaną płytkę selektywną.
11. Inkubować przez noc w 37°C.

Po inkubacji na płytkach pojawiają się białe i niebieskie kolonie. Kolonie białe są dodatnie pod kątem wstawienia produktu PCR, natomiast kolonie niebieskie są ujemne pod kątem wstawienia produktu PCR.

6. Analiza sekwencjonowania

Reakcja sekwencjonowania

1. Przygotowuje się mieszaninę z następujących odczynników: 2,5 μl DNA, 1 μl primera (5pmol/ μl) oraz 1,1 μl BigDye (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA).
2. Warunki w termocyklerze: 96°C przez 1 minutę; następnie 25 cykli: 96°C przez 10 s, 55°C przez 15 s oraz 60°C przez 4 min.

Oczyszczanie kolumnowe

1. Dla każdej reakcji przygotować jedną koluminkę MicroSpin (Qiagen, , Mediolan, Włochy).
2. Odwrócić koluminkę i wymieszać żywicę za pomocą wibratora (vortex).
3. Odłamać dno koluminki, poluzować zakrętkę o ¼ obrotu i umieścić koluminkę w probówce do mikrowirówki.
4. Wirować przy 3200 rpm przez 1 minutę.
5. Przenieść koluminkę do czystej probówki do mikrowirówki.
6. Ostrożnie pipetować całą reakcję PCR do sekwencjonowania do centrum koluminki.
7. Wirować przy 3200 rpm przez 1 minutę.
8. Oczyszczony DNA zostanie wymyty do probówki (20 μl wody ultrapure).

Analiza sekwencjonowania

1. Nanieś oczyszczoną próbkę (20 μl) na płytkę 96-dołkową.
2. Umieść płytkę w sekwenatorze. Automatyczne sekwenatory DNA generują czterokolorowy chromatogram przedstawiający wyniki przebiegu sekwencjonowania.
3. Wprowadź sekwencję nukleotydową jako zapytanie do publicznych baz danych sekwencji. Wyszukiwanie jest przeprowadzane w bazach i na serwerach NCBI przy użyciu narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
4. Uwzględnij tylko bakterie o homologii na poziomie 98-100%.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Harmonogram procedury.

Rysunek 2. Schematy blokowe całej procedury identyfikacji bakteryjnej.

Rysunek 3. 2% żel agarozowy wykazujący produkty PCR genu 16S rRNA o szerokim zakresie. Ścieżka 1 zawiera drabinę DNA 100bp, ścieżka 2 zawiera pozytywną kontrolę PCR, ścieżka 3 wykazuje negatywną kontrolę PCR. Ścieżka 4 wykazuje próbki od pacjenta z dodatnim wynikiem testu na HIV, a ścieżka 5 zawiera wodę. Ścieżka 6 wykazuje próbki od zdrowej osoby oraz negatywną reakcję PCR; ścieżka 7 zawiera wodę. Tylko u pacjentów z dodatnim wynikiem testu na HIV stwierdzono pozytywną amplifikację PCR. Woda ultrapure użyta jako kontrola negatywna podczas etapu ekstrakcji wskazuje, że nie doszło do kontaminacji.

Rycina 4. 0,7% żel agarozowy przedstawiający plazmid wyizolowany metodą miniprep. Ścieżka 1 zawiera drabinę DNA 1 Kilobase, ścieżka 2 zawiera niebieską kolonię kontrolną, ścieżki od 3 do 12 zawierają kolonie białe. Plazmid z niebieskiej kolonii nie zawiera insertu będącego produktem PCR. Wszystkie 10 białych kolonii zawiera plazmid z prawidłowym insertem.

Rysunek 5. Przedstawia przykład analizy sekwencjonowania bakterii w osoczu jednego pacjenta z HIV. Nasze wyniki wykazują, że translokacja drobnoustrojów w przebiegu HIV obejmuje florę polimikrobiologiczną, której nie obserwuje się u osób HIV-ujemnych, co sugeruje znaczne zaburzenie odporności jelitowej w kontrolowaniu translokacji bakterii.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół PCR/sekwencjonowania służący do charakterystyki translokacji bakterii do krwi obwodowej u osób zakażonych wirusem HIV.

Najbardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się przy użyciu osocza pobranego do probówek zawierających EDTA. Po pobraniu krwi osocze należy oddzielić poprzez wirowanie w ciągu 2/3 godzin, aby uniknąć hemolizy i degradacji fragmentów DNA. Próbki przechowuje się początkowo w temperaturze -20°C przez około 5 dni, a następnie w -80°C. Należy u...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Easy-DNA	Invitrogen	K 180001
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7203
Woda UltraPure	Invitrogen	10977049
Lizozym	Fluka	62970	10 μg/mL w wodzie destylowanej
AmpliTaq Gold	Applied Biosystems	26478701
Microcon 100	EMD Millipore	42413
Startery PCR	Invitrogen
Agaroza	Eppendorf	C1343
Marker DNA	Invitrogen	15628019
Zestaw Purelink PCR micro	Invitrogen	K310050
Agar LB, proszek	Invitrogen	22700025
Bactoagar	Invitrogen
Ampicylina	Invitrogen	11593027	10 mg/mL w wodzie destylowanej
X-gal	Invitrogen	15520034	40mg/mL w DMF
IPTG	Invitrogen	15529019	100mM w wodzie destylowanej
Zestaw do klonowania Topo TA	Invitrogen	K450002
Zestaw Purelink Quick Plasmid Miniprep	Invitrogen	K210010
Big dye	Applied Biosystems	4337455
Zestaw kolumienkowy DyeEx 2.0	Qiagen	63204