Nasz eksperyment pokaże, jak przeprowadzić analizę sekwencjonowania gatunków bakterii translokujących do krwi obwodowej pacjentów z dodatnim wynikiem testu na HIV.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami z zakażeniem HIV
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdrowy przewód pokarmowy jest fizjologicznie kolonizowany przez szeroką gamę drobnoustrojów komensalnych, które wpływają na rozwój humoralnego i komórkowego układu odporności śluzówkowej1,2.
Mikrobiota jest chroniona przed układem odpornościowym przez silną barierę śluzową. Wiadomo, że infekcje i antybiotyki zmieniają zarówno naturalną barierę przewodu pokarmowego, jak i skład bakterii rezydentnych, co może prowadzić do możliwych nieprawidłowości immunologicznych3.
HIV powoduje naruszenie bariery żołądkowo-jelitowej z postępującym upośledzeniem odporności śluzówkowej oraz przedostawaniem się do krążenia systemowego produktów bakteryjnych, takich jak lipopolisacharydy i fragmenty bakteryjnego DNA, co przyczynia się do systemowej aktywacji immunologicznej4-7. Translokacja drobnoustrojów jest zaangażowana w immunopatogenezę HIV/AIDS oraz w odpowiedź na terapię 4,8.
Naszym celem była charakterystyka składu bakterii translokujących do krwi obwodowej u pacjentów zakażonych HIV. Aby zrealizować ten cel, przeprowadziliśmy reakcję PCR dla panbakteryjnego genu 16S rRNA, a następnie wykonaliśmy analizę sekwencjonowania.
W skrócie, wykorzystywana jest krew pełna pobrana zarówno od osób zakażonych HIV, jak i od osób zdrowych. Biorąc pod uwagę, że u osób zdrowych występuje prawidłowa homeostaza jelitowa, u tych pacjentów nie spodziewa się translokacji mikroflory. Po pobraniu krwi pełnej drogą wenerpunkcji i oddzieleniu osocza, z osocza ekstrahuje się DNA, które jest następnie wykorzystywane do reakcji PCR o szerokim zakresie dla panbakteryjnego genu rybosomalnego 16S9. Po puryfikacji produktu PCR przeprowadzane są analizy klonowania i sekwencjonowania.
Protokół
Obsługa próbek krwi zakażonych HIV wymaga przestrzegania kilku istotnych zaleceń.
Wszystkie próbki krwi muszą być transportowane w wytrzymałych, szczelnych pojemnikach. Podczas pobierania próbki należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia zewnętrznej strony pojemnika oraz wszelkiej dokumentacji towarzyszącej próbce.
Wszystkie osoby przetwarzające zakażoną krew muszą nosić rękawiczki. Po zakończeniu obróbki próbki należy zmienić rękawiczki i umyć ręce.
Obróbka próbek krwi zakażonych HIV musi być przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II (biohazard cabinet hood).
Należy stosować mechaniczne pomoce do pipetowania.
Stosowanie igieł lub innych ostrych narzędzi (w tym szkła, np. pipet lub kapilar) musi być ograniczone do sytuacji, w których nie ma alternatywy.
Powierzchnie laboratoryjne muszą zostać zdekontaminowane odpowiednim chemicznym środkiem dezynfekcyjnym po rozlaniu krwi oraz po zakończeniu prac.
Użyte materiały zanieczyszczone muszą zostać zdekontaminowane przed ponownym użyciem lub prawidłowo zutylizowane jako odpady kliniczne.
Każdy przypadek narażenia zawodowego na potencjalnie zakażoną krew lub płyny (tzn. takie, które wymagają stosowania środków ostrożności uniwersalnych) należy traktować jako nagły przypadek medyczny, ponieważ interwencje muszą zostać podjęte niezwłocznie, aby były skuteczne.
Realizacja protokołu zajmuje 5 dni. Harmonogram przedstawiono szczegółowo na Ryc. 1.
Gatunki bakterii są identyfikowane przy użyciu metod opisanych na Ryc. 2.
1. Pobieranie próbek
- 9 ml krwi pełnej pobiera się do probówek zawierających EDTA.
- Probówki wiruje się przy 2000 rpm przez 10 minut w RT w celu uzyskania osocza.
- Osocze przenosi się do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml.
2. Ekstrakcja DNA z próbek osocza
- Odpowiednio zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza, pipety oraz materiały niezbędne do eksperymentu, aby zagwarantować sterylność.
- Umieścić wszystkie materiały pod lampami UV na co najmniej 30 minut.
- Przetrzeć rękawiczki środkiem dezynfekującym.
- Nasączyć kilka ręczników papierowych etanolem i umieścić je w komorze. Po każdym wyrzuceniu końcówki przetrzeć pipetę wilgotnymi ręcznikami papierowymi.
DNA jest ekstrahowane przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (Easy-DNA Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).
- 350 μL plazmy umieszcza się w sterylnej probówce Eppendorf o pojemności 2ml.
- 350 μL filtrowanej wody ultrapurej stosuje się jako kontrolę negatywną.
- Do próbek dodaje się 10 μL lizozymu (1mg/ml).
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.
- Do próbek dodaje się 500 μL roztworu lizującego (Lysis Solution) i delikatnie miesza.
- Inkubować przez 7 minut w temperaturze 65°C.
- Do próbek dodaje się 900 μL chloroformu.
- Wymieszać intensywnie w wortexie, aż próbki osiągną jednolitą lepkość.
- Dodać 200 μL roztworu wytrącania (Precipitation Solution) i intensywnie wymieszać w wortexie.
- Wirować próbki przy 10500 rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu rozdzielenia faz i utworzenia interfazy.
- Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 ml 100% etanolu.
- Wirować próbki przy 10500 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C.
- Usunąć etanol.
- Dodać 1ml 70% etanolu.
- Wirować próbki z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4°C.
- Usunąć etanol. Pozostałości etanolu należy usunąć za pomocą pipetora.
- Resuspender osad w 50 μL wody ultrapurej.
- Odczytać stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
3. PCR genu 16S rRNA
Amplifikację PCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem 9.
- Przeprowadzić amplifikację DNA w 100 μL mieszaninie reakcyjnej składającej się z 10 μL buforu PCR 10X, 5 μL 25 mM MgCl2, 5 μL 2 mM całkowitej ilości dNTPs, 1 μL 50 μM startera RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 μL 50 μM startera DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 μL H20 oraz 0,5 μL polimerazy Taq (AmpliTaq Gold, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA).
- Przenieść mieszaninę PCR do filtrów, aby uniknąć możliwej kontaminacji bakteryjną polimerazą Taq.
- Wirować filtry (Microcon, Millipore, Billerica, MA, USA) przez 30 minut przy 500 rcf w temperaturze 4°C.
- Rozdzielić mieszaninę PCR na aliquoty zgodnie z liczbą próbek przeznaczonych do amplifikacji (dodatnie i ujemne kontrole PCR, próbki oraz ekstrahowana woda).
- Zastosować następujące warunki cyklera termicznego: 94°C przez 10 minut; 40 cykli po 1 minucie każdy w temperaturach 94°C, 55°C i 72°C, oraz 10 min w 72°C.
- Wizualizować produkt PCR na 2% żelu agarozowym. Użyć drabinki DNA 100 bp. Wielkość produktu PCR wynosi około 360 bp (Rycina 3).
4. Oczyszczanie produktu PCR
Należy oczyścić wyłącznie próbki dodatnie w teście PCR. Oczyszczanie przeprowadza się przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (PureLink PCR microkit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).
- Dodaj 4 objętości buforu wiążącego (Binding Buffer) zawierającego izopropanol na 1 objętość produktu PCR.
- Przenieś produkt PCR z buforem wiążącym do kolumny.
- Wiruj przez 1 minutę przy 10000 rcf w temperaturze RT.
- Przemyj kolumnę buforem płuczącym (Wash Buffer) zawierającym etanol.
- Wiruj przez 1 minutę przy 10000 rcf w temperaturze RT.
- Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze RT, aby osuszyć membranę krzemionkową i usunąć pozostałości buforu płuczącego z etanolem.
- Dodaj 10 μL wody ultrapure.
- Inkubuj przez 1 minutę w temperaturze RT.
- Wiruj z maksymalną prędkością przez 2 minuty w temperaturze RT, aby zebrać oczyszczone DNA.
5. Klonowanie
Przygotowanie szalek z pożywką Lysogeny Broth (LB)
- Rozpuścić 25 gr mieszanki LB w około 800 ml wody.
- Dopełnić objętość końcową do 1 L.
- Dodać 15 gr Bactoagaru.
- Autoklawować przez 20 minut.
- Po autoklawowaniu energicznie zamieszać roztwór w kolbie, aby wymieszać stopiony agar.
- Schłodzić roztwór do 50°C.
- Dodać ampicylinę (50 μg/ml) i mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
- Wylać pożywkę na płytki do grubości około 3mm.
- Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej.
- Nanieść X-Gal (40mg/ml) i IPTG (100 mM) na każdą płytkę LB i inkubować w 37°C do momentu użycia.
Transformacja komórek kompetentnych
Transformację przeprowadza się przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (Topo TA cloning kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).
- Przygotować mieszaninę do reakcji klonowania (1-4 μL świeżego produktu PCR, 1 μL roztworu soli, 1 μL wektora oraz wodę, jeśli jest to konieczne).
- Delikatnie wymieszać reakcję i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Umieścić reakcję na lodzie.
- Do probówki z komórkami kompetentnymi dodać 2 μL mieszaniny z reakcji klonowania i delikatnie wymieszać.
- Inkubować na lodzie przez 30 minut.
- Poddać komórki szokowi termicznemu przez 30 sekund w temperaturze 42°C.
- Natychmiast przenieść probówkę na lód.
- Dodać 250 μL pożywki.
- Szczelnie zamknąć probówkę i inkubować w wytrząsarce poziomej w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
- Wysiać 50 μL z każdej transformacji na uprzednio ogrzaną płytkę selekcyjną.
- Inkubować przez noc w temperaturze 37°C.
Po inkubacji na płytkach rozwiną się kolonie białe i niebieskie. Kolonie białe są dodatnie pod kątem insercji produktu PCR, natomiast kolonie niebieskie są ujemne pod kątem insercji produktu PCR.
6. Analiza sekwencjonowania
Reakcja sekwencjonowania
- Przygotowuje się mieszaninę z następujących odczynników: 2,5 μl DNA, 1 μl primera (5pmol/ μl), 1,1 μl BigDye (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA ).
- Warunki termocyklera: 96°C przez 1 minutę; 25 cykli: 96°C przez 10 sec, 55°C przez 15 sec i 60°C przez 4 min.
Oczyszczanie kolumnowe
- Dla każdej reakcji przygotuj jedną kolumnę MicroSpin (Qiagen, , Mediolan, Włochy).
- Odwróć kolumnę i wymieszaj żywicę za pomocą wortexa.
- Odłam dno kolumny, poluzuj pokrywkę o ¼ obrotu i umieść kolumnę w probówce do mikrowirówki.
- Wiruj przy 3200 rpm przez 1 minutę.
- Przenieś kolumnę do czystej probówki do mikrowirówki.
- Ostrożnie nanieś pipetą całą reakcję PCR do sekwencjonowania do centrum kolumny.
- Wiruj przy 3200 rpm przez 1 minutę.
- Oczyszczone DNA zostanie eluowane do probówki (20 μl wody ultrapure).
Analiza sekwencjonowania
- Nanieś oczyszczoną próbkę (20 μl) do płytki 96-dołkowej.
- Włóż płytkę do sekwenatora. Automatyczne sekwenatory DNA generują czterokolorowy chromatogram przedstawiający wyniki przebiegu sekwencjonowania.
- Wprowadź sekwencję nukleotydową jako zapytanie do publicznych baz danych sekwencji. Przeszukiwanie jest wykonywane w bazach danych i na serwerach NCBI za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
- Uwzględnij tylko bakterie wykazujące 98-100% homologii.
7. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Harmonogram procedury.
Rysunek 2. Schematy blokowe całej procedury identyfikacji bakteryjnej.
Rycina 3. 2% żel agarozowy przedstawiający produkty PCR genu 16S rRNA o szerokim zakresie. Ścieżka 1 zawiera marker DNA 100bp, ścieżka 2 zawiera pozytywną kontrolę PCR, ścieżka 3 przedstawia negatywną kontrolę PCR. Ścieżka 4 przedstawia próbki od pacjenta z dodatnim wynikiem testu na HIV, a ścieżka 5 zawiera wodę. Ścieżka 6 przedstawia próbki od zdrowej osoby oraz negatywną reakcję PCR; ścieżka 7 zawiera wodę. Tylko u pacjentów z dodatnim wynikiem HIV widoczna jest pozytywna amplifikacja PCR. Woda ultrapure użyta jako kontrola negatywna podczas etapu ekstrakcji wskazuje, że nie doszło do kontaminacji.
Rysunek 4. Żel agarozowy 0,7% przedstawiający plazmid wyekstrahowany procedurą miniprep. Ścieżka 1 zawiera marker DNA 1 Kilobase, ścieżka 2 zawiera niebieską kolonię kontrolną, a ścieżki od 3 do 12 zawierają kolonie białe. Plazmid z niebieskiej kolonii nie zawiera wkładki z produktu PCR. Wszystkie 10 białych kolonii zawiera plazmid z prawidłową wkładką.
Rycina 5. Przedstawia przykład analizy sekwencjonowania bakterii w osoczu jednego osobnika seropozytywnego w kierunku HIV. Nasze wyniki pokazują, że translokacja drobnoustrojów w przebiegu zakażenia HIV obejmuje florę polimikrobową, czego nie obserwuje się u osób HIV-ujemnych, co sugeruje znaczną niewydolność odporności jelitowej w kontrolowaniu translokacji bakterii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół PCR/sekwencjonowania służący do charakterystyki translokacji bakterii do krwi obwodowej u osób zakażonych wirusem HIV.
Najbardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się przy użyciu osocza pobranego do probówek zawierających EDTA. Po pobraniu krwi osocze należy oddzielić poprzez wirowanie w ciągu 2/3 godzin, aby uniknąć hemolizy i degradacji fragmentów DNA. Próbki przechowuje się początkowo w temperaturze -20°C przez około 5 dni, a następnie w -80°C. Należy u...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Gianni Scimone za doskonałą pomoc w realizacji filmu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw Easy-DNA | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| Woda UltraPure | Invitrogen | 10977049 | |
| Lizozym | Fluka | 62970 | 10 μg/mL w wodzie destylowanej |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystems | 26478701 | |
| Microcon 100 | EMD Millipore | 42413 | |
| Startery PCR | Invitrogen | ||
| Agaroza | Eppendorf | C1343 | |
| Marker DNA | Invitrogen | 15628019 | |
| Zestaw Purelink PCR micro | Invitrogen | K310050 | |
| Agar LB, proszek | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicylina | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL w wodzie destylowanej |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL w DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM w wodzie destylowanej |
| Zestaw do klonowania Topo TA | Invitrogen | K450002 | |
| Zestaw Purelink Quick Plasmid Miniprep | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Zestaw kolumienkowy DyeEx 2.0 | Qiagen | 63204 |
Bibliografia
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
- Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
- Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
- Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
- Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
- Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
- Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).
- Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
