Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe nadekspresji plazmidu drożdży

Podsumowanie

Tutaj opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidu u Saccharomyces cerevisiae, korzystając z biblioteki plazmidów z tablicą i protokołu transformacji drożdży o wysokiej przepustowości za pomocą robota do obsługi cieczy.

Streszczenie

Pączkujące drożdże, Saccharomyces cerevisiae, to potężny system modelowy do definiowania podstawowych mechanizmów wielu ważnych procesów komórkowych, w tym tych mających bezpośrednie znaczenie dla chorób ludzkich. Ze względu na krótki czas wytwarzania i dobrze scharakteryzowany genom, główną zaletą eksperymentalną systemu modelowego drożdży jest możliwość wykonywania genetycznych badań przesiewowych w celu identyfikacji genów i ścieżek, które są zaangażowane w dany proces. W ciągu ostatnich trzydziestu lat takie genetyczne badania przesiewowe były wykorzystywane do wyjaśnienia cyklu komórkowego, szlaku wydzielniczego i wielu innych wysoce konserwatywnych aspektów biologii komórek eukariotycznych ^1-5. W ciągu ostatnich kilku lat wygenerowano kilka bibliotek obejmujących cały genom szczepów drożdży i plazmidów ^6-10. Kolekcje te pozwalają obecnie na systematyczne badanie funkcji genów przy użyciu podejść opartych na zyskach i stratach funkcji ^11-16. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół użycia protokołu transformacji drożdży o wysokiej przepustowości z robotem do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia badania przesiewowego nadekspresji plazmidu, przy użyciu uporządkowanej biblioteki 5,500 plazmidów drożdży. Używaliśmy tych badań przesiewowych do identyfikacji genetycznych modyfikatorów toksyczności związanych z akumulacją podatnych na agregację ludzkich białek chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawione tutaj metody można łatwo dostosować do badania innych fenotypów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania.

Protokół

1. Preparaty do przemiany drożdży

Ten protokół jest przeznaczony dla dziesięciu płytek 96-dołkowych, ale może być odpowiednio skalowany w górę lub w dół. Odkryliśmy, że ten protokół nie działa dobrze dla więcej niż dwudziestu 96-dołkowych płytek na rundę transformacji. Cała procedura transformacji (od kroku I.3) potrwa około ośmiu godzin.

1. Porcjować 5-10 μl plazmidowego DNA (100 ng / μl) z biblioteki drożdży FLEXGene ORF do każdej studzienki 96-dołkowej płytki okrągłodennej za pomocą płynu Biorobot RapidPlate. Umieść odkryte 96-dołkowe płytki na noc w czystym dygestorium do wyschnięcia. Znaleźliśmy podobną wydajność transformacji w przypadku CEN i plazmidów drożdży 2μ.
2. Zaszczep 200 ml pożywki z dekstrozy peptonu drożdżowego (YPD) (10 g / l ekstraktu drożdżowego, 20 g / l peptonu, 20 g / l glukozy) szczepem zapytania w 500 ml przegrodowanej kolbie Erlenmeyera. Inkubować przez noc w temperaturze 30°C z wytrząsaniem (200 obr./min). W razie potrzeby do tych kultur starterowych można również użyć pożywek selektywnych.
3. Następnego ranka rozcieńczyć szczep zapytania do OD₆₀₀ = 0,1 w 2L YPD. Wstrząsaj przez 4-6 godzin w temperaturze 30 ° C (200 obr./min), aż kultura osiągnie OD₆₀₀ = 0,8-1,0. Aby uzyskać optymalny wzrost, hoduj dwie kultury o pojemności 1 l w oddzielnych kolbach z przegrodami o pojemności 2,8 l. W razie potrzeby zamiast YPD można również użyć pożywek selektywnych.

2. Przemiana drożdży

1. Zbieraj komórki przez odwirowanie. Napełnij cztery jednorazowe probówki stożkowe o pojemności 225 ml kulturą drożdży i wiruj z prędkością 3000 obr./min ( ̃1800 x g) przez 5 minut w wirówce stołowej (Eppendorf 5810R). Odlej supernatant i powtarzaj, aż wszystkie komórki zostaną zebrane.
2. Umyj komórki w 200 ml autoklawowanego destylowanego H₂O. Ponownie zawiesić osad komórkowy przez potrząsanie lub wirowanie. Połącz komórki w jednej stożkowej probówce o pojemności 225 ml. Wiruj z prędkością 3000 obr./min przez 5 minut. Usunąć supernatant.
3. Przygotować roztwór 0,1MLiOAc/1XTE (0,1M LiOAc, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 w autoklawowanej wodzie destylowanej). Umyj komórki w 100 ml 0,1MLiOAc/1XTE. Wiruj z prędkością 3000 obr./min przez 5 minut. Usunąć supernatant.
4. Zawieś osad komórkowy w 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Wstrząsnąć i/lub przetrząsnąć, aby upewnić się, że osad jest całkowicie zawieszony.
5. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 30 minut (200 obr./min).
6. Dodaj β-merkaptoetanol do 0,1 M. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 30 minut (200 obr./min). Uwaga: Ten krok można pominąć, jeśli używasz szczepów drożdży, które są wrażliwe na β-merkaptoetanol. Odkryliśmy, że ten krok nie jest niezbędny do udanej transformacji, jednak poprawia jej efektywność.
7. Gotuj 2 ml sonikowanego DNA plemników łososia (10 mg/ml) przez 15 minut, a następnie schładzaj na lodzie.
8. Dodaj 2 ml DNA ugotowanego plemnika łososia do mieszaniny komórek. Uwaga: Po dodaniu DNA plemników łososia do mieszaniny komórek może powstać osad. Za pomocą pipetatora i końcówki o pojemności 200 μl należy ostrożnie usunąć powstający osad, ponieważ może to zakłócić dalsze pipetowanie.
9. Porcję 50 μl mieszaniny komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej za pomocą BioRobot Rapidplate (można również użyć pipety wielokanałowej). Nie mieszać.
10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wstrząsania.
11. Przygotuj 200 ml 40% PEG-3350/10%DMSO/0,1M LiOAc (160 ml 50% PEG-3350, 20 ml DMSO, 20 ml 1M LiOAc). Przygotować roztwór bezpośrednio przed użyciem.
12. Dodaj 125 μl roztworu PEG/LioAc/DMSO do każdej studzienki. Wymieszać przez zasysanie i dozowanie zawiesiny komórek osiem razy z RapidPlate.
13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wstrząsania.
14. Szok termiczny komórek w temperaturze 42°C przez 15 minut w suchym inkubatorze. Nie układaj talerzy w stosy. Uwaga: Odkryliśmy, że ten etap szoku cieplnego nie jest niezbędny do udanej transformacji. W przypadku niektórych szczepów drożdży (na przykład mutantów wrażliwych na temperaturę) szok cieplny jest szkodliwy. Wcześniej skróciliśmy czas szoku cieplnego do jednej minuty i byliśmy w stanie z powodzeniem przekształcić szczep drożdży posiadający mutację wrażliwą na temperaturę ypt1 przy użyciu tego protokołu.
15. Wiruj płytki z prędkością 2500 obr./min ( ̃1100 x g) przez 5 minut, używając adapterów wirówek, aby pomieścić płytki 96-dołkowe. Usuń roztwór PEG, odwracając płytki nad wiadrem na odpady. Osusz odwrócony talerz na ręczniku papierowym, aby usunąć resztki płynu (komórki pozostaną na dnie studzienek).
16. Przepłucz komórki, dodając 200 μl minimalnej ilości pożywki (np. SD/-Ura) do każdego dołka za pomocą RapidPlate.
17. Obracaj talerze z prędkością 2500 obr./min przez 5 minut i usuń supernatant, odwracając wiadro na śmieci i osuszając ręczniki papierowe.
18. Dodaj 200 μl minimalnej ilości pożywki (np. SD/-Ura) do każdego dołka za pomocą RapidPlate.
19. Inkubować w temperaturze 30°C przez 2 dni bez wstrząsania. Po 2 dniach na dnie każdej pomyślnie przekształconej studni powinny zacząć tworzyć się małe kolonie komórek.

3. Test plamienia

1. Dozować 200 μl minimalnej pożywki na bazie rafinozy (np. SRaf/-Ura) do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.
2. Wymieszać każdą studzienkę płytki transformacyjnej, zasysając i dozując zawiesinę komórek osiem razy za pomocą Rapidplate.
3. Zaszczepić płytki SRaf 5 μl mieszaniny komórek z płytki transformacyjnej.
4. Inkubować w temperaturze 30°C przez jeden dzień. Małe kolonie powinny znajdować się na dnie każdej studzienki po jednym dniu.
5. Punktowe kolonie na płytkach SD/-Ura i SGal/-Ura w kapturze. Sterylizuj 96-śrubowy replikator (frogger) przez płomieniowanie. Wymieszaj kolonie z żabą przed nakrapianiem na selektywnych płytkach pożywki. Po plamieniu pozostaw płytki do wyschnięcia w kapturze na 5-10 minut.
6. Inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 dni.

Sfotografuj kliszki aparatem cyfrowym i wizualnie porównaj wzrost kolonii na płytkach SGal/-Ura, aby znaleźć kolonie, w których toksyczność szczepu zapytania jest zwiększona (wolniejszy wzrost / mniej gęste kolonie) lub stłumiona (szybszy wzrost / gęstsze kolonie).

4. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Badanie przesiewowe nadekspresji plazmidu drożdży w celu identyfikacji supresorów i wzmacniaczy toksyczności TDP-43. TDP-43 jest ludzkim białkiem, które bierze udział w patogenezie stwardnienia zanikowego bocznego (choroba Lou Gehriga). Agregaty cytoplazmatyczne TDP-43 gromadzą się w neuronach mózgu i rdzenia kręgowego pacjentów z ALS ¹⁷. Ekspresja TDP-43 w komórkach drożdży powoduje agregację i cytotoksyczność ¹⁸. Wykorzystaliśmy ten system modelowy do zdefiniowania mechanizmów toksyczności TDP-43 ^19,20. Pokazano reprezentatywne przykłady płytek z naszego sita modyfikatora toksyczności TDP-43 drożdży. Płytki te wyświetlają kolonie ze zintegrowanym plazmidem TDP-43 indukowanym galaktozą, a także transformowane plazmidami z biblioteki ekspresji FLEXGene ORF. Płytka po lewej stronie zawiera glukozę, która hamuje ekspresję TDP-43 lub plazmidów FLEXGene. Płytka po prawej stronie zawiera galaktozę, która indukuje ekspresję TDP-43 i ORF w plazmidach FLEXGene. Zielony grot strzałki wskazuje kolonię przekształconą za pomocą plazmidu, który tłumi toksyczność TDP-43. Czerwony grot strzałki wskazuje kolonię przekształconą w plazmid, który zwiększa toksyczność TDP-43.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego nadekspresji plazmidu u drożdży. Takie podejście pozwala na szybkie i bezstronne badania przesiewowe pod kątem modyfikatorów genetycznych wielu różnych fenotypów komórkowych. Korzystając z tego podejścia, badacz może przebadać znaczną część genomu drożdży w ciągu kilku tygodni. To bezstronne podejście pozwala również na identyfikację modyfikatorów, których nie można było przewidzieć na podstawie wcześniejszych ustaleń. Zas...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BioRobot RapidPlate	Qiagen	9000490
96 replikator (frogger)	V& P Scientific	VP404
FLEXGene ORF Biblioteka	Instytut Proteomiki, Harvard Medical School
Wirówka stołowa	Eppendorf	5810R
500mL kolba z przegrodą	Bellco Glass	2543-00500
2,8 l potrójnie przegrodowa kolba Fernbach	Bellco Glass	2551-02800
100μ L Końcówki do pipet	Rapidplate Axygen Scientific	ZT-100-R-S
200μ L Końcówki do pipet Rapidplate	Axygen Scientific	ZT-200-R-S