Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

15.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2836

⸱

27 lipca 2011

 , 
1Neuroscience Graduate Group, University of Pennsylvania School of Medicine , 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Streszczenie

Drożdże pączkujące, Saccharomyces cerevisiae, stanowią potężny system modelowy do definiowania fundamentalnych mechanizmów wielu istotnych procesów komórkowych, w tym tych bezpośrednio związanych z chorobami ludzi. Ze względu na krótki czas generacji i dobrze scharakteryzowany genom, główną zaletą eksperymentalną modelu drożdżowego jest możliwość przeprowadzania przesiewów genetycznych w celu identyfikacji genów i szlaków zaangażowanych w dany proces. W ciągu ostatnich trzydziestu lat takie przesiewy genetyczne były wykorzystywane do wyjaśnienia cyklu komórkowego, szlaku wydzielniczego oraz wielu innych wysoce konserwatywnych aspektów biologii komórki eukariotycznej 1-5. W ostatnich kilku latach stworzono kilka bibliotek szczepów drożdży i plazmidów obejmujących cały genom 6-10. Kolekcje te umożliwiają obecnie systematyczne badanie funkcji genów z wykorzystaniem podejść opartych na zwiększeniu (gain-of-function) i utracie funkcji (loss-of-function) 11-16. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół wykorzystania wysokoprzepustowej metody transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy w celu przeprowadzenia przesiewu nadekspresji plazmidowej z wykorzystaniem uporządkowanej biblioteki 5 500 plazmidów drożdżowych. Wykorzystujemy te przesiewy do identyfikacji genetycznych modyfikatorów toksyczności związanej z akumulacją białek chorób neurodegeneracyjnych człowieka podatnych na agregację. Przedstawione tutaj metody można łatwo zaadaptować do badania innych interesujących fenotypów komórkowych.

Protokół

1. Przygotowania do transformacji drożdży

Niniejszy protokół został opracowany dla dziesięciu płytek 96-dołkowych, lecz można go odpowiednio przeskalować w górę lub w dół. Stwierdziliśmy, że protokół ten nie sprawdza się w przypadku więcej niż dwudziestu płytek 96-dołkowych w jednej serii transformacji. Cała procedura transformacji (od kroku I.3) zajmie około ośmiu godzin.

  1. Za pomocą systemu do dozowania cieczy Biorobot RapidPlate nanieś aliquoty 5-10μL plazmidowego DNA (100 ng/μl) z biblioteki Yeast FLEXGene ORF do każdego dołka okrągłego płyty 96-dołkowej. Pozostaw nieprzykryte płyty 96-dołkowe w czystej komorze z wyciągiem na noc w celu wysuszenia. Odnotowaliśmy podobną wydajność transformacji w przypadku plazmidów drożdżowych CEN i 2μ.
  2. Zaszczep 200mL pożywki peptone dextrose (YPD) dla drożdży (10g/L ekstraktu drożdżowego, 20g/L peptonu, 20g/L glukozy) szczepem badanym w kolbie Erlenmeyera z przegrodami o pojemności 500mL. Inkubuj przez noc w temperaturze 30°C przy potrząsaniu (200 rpm). W razie potrzeby do tych kultur startowych można zastosować również pożywki selektywne.
  3. Następnego ranka rozcieńcz szczep badany do OD600=0,1 w 2L pożywki YPD. Potrząsaj przez 4-6 godzin w temperaturze 30°C (200 rpm), aż kultura osiągnie OD600=0,8-1,0. Dla uzyskania optymalnego wzrostu wyhoduj dwie kultury po 1L w oddzielnych kolbach z przegrodami o pojemności 2,8 L. W razie potrzeby zamiast YPD można zastosować pożywki selektywne.

2. Transformacja drożdży

  1. Zebrać komórki poprzez wirowanie. Napełnić cztery jednorazowe probówki stożkowe o pojemności 225mL kulturą drożdży i wirować przy 3000rpm (˜1800 x g) przez 5 minut w wirówce laboratoryjnej (Eppendorf 5810R). Odlać nadsącz i powtarzać czynność aż do zebrania wszystkich komórek.
  2. Przemyć komórki w 200mL autoklawowanej wody destylowanej H2O. Resuspender osad komórkowy poprzez potrząsanie lub wortexowanie. Połączyć komórki w jednej probówce stożkowej 225mL. Wirować przy 3000rpm przez 5 minut. Usunąć nadsącz.
  3. Przygotować roztwór 0.1MLiOAc/1XTE (0.1M LiOAc, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 w autoklawowanej wodzie destylowanej). Przemyć komórki w 100mL 0.1MLiOAc/1XTE. Wirować przy 3000rpm przez 5 minut. Usunąć nadsącz.
  4. Resuspender osad komórkowy w 70mL 0.1M LiOAc/1xTE. Potrząsać i/lub wortexować, aby upewnić się, że osad został całkowicie zresuspendowany.
  5. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 30 minut (200 rpm).
  6. Dodać β-merkaptoetanol do stężenia 0.1M. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 30 minut (200 rpm). Uwaga: Ten krok można pominąć w przypadku stosowania szczepów drożdży wrażliwych na β-merkaptoetanol. Stwierdzono, że krok ten nie jest niezbędny do pomyślnej transformacji, jednak zwiększa on jej wydajność.
  7. Gotować 2mL sonikowanego DNA z plemników łososia (10mg/mL) przez 15 minut, a następnie schłodzić na lodzie.
  8. Dodać 2mL gotowanego DNA z plemników łososia do mieszaniny komórkowej. Uwaga: Po dodaniu DNA z plemników łososia do mieszaniny komórkowej może powstać osad. Używając pipety automatycznej z końcówką 200 μl, ostrożnie usunąć wszelki powstały osad, ponieważ może on utrudniać późniejsze pipetowanie.
  9. Nanieść 50μL mieszaniny komórkowej do każdej studni płytki 96-dołkowej za pomocą BioRobot Rapidplate (można również użyć pipety wielokanałowej). Nie mieszać.
  10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wytrząsania.
  11. Przygotować 200mL roztworu 40%PEG-3350/10%DMSO/0.1M LiOAc (160mL 50% PEG-3350, 20mL DMSO, 20mL 1M LiOAc). Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  12. Dodać 125μL roztworu PEG/LioAc/DMSO do każdej studni. Wymieszać poprzez ośmiokrotne odessanie i wydanie zawiesiny komórkowej za pomocą RapidPlate.
  13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut bez wytrząsania.
  14. Poddać komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42°C przez 15 minut w inkubatorze suchym. Nie układać płytek w stosy. Uwaga: Stwierdzono, że ten krok szoku termicznego nie jest niezbędny do pomyślnej transformacji. Dla niektórych szczepów drożdży (np. mutantów wrażliwych na temperaturę) szok termiczny jest szkodliwy. Wcześniej skrócono czas szoku termicznego do jednej minuty, co pozwoliło na pomyślną transformację szczepu drożdży posiadającego mutację temperaturozależną ypt1 przy użyciu tego protokołu.
  15. Wirować płytki przy 2500rpm (˜1100 x g) przez 5 minut, używając adapterów do wirówek przeznaczonych dla płytek 96-dołkowych. Usunąć roztwór PEG, odwracając płytki nad pojemnikiem na odpady. Osuszyć odwróconą płytkę ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki cieczy (komórki pozostaną na dnie studni).
  16. Przepłukać komórki, dodając 200μL pożywki minimalnej (np. SD/-Ura) do każdej studni za pomocą RapidPlate.
  17. Wirować płytki przy 2500rpm przez 5 minut i usunąć nadsącz, odwracając je nad pojemnikiem na odpady i osuszając ręcznikami papierowymi.
  18. Dodać 200μL pożywki minimalnej (np. SD/-Ura) do każdej studni za pomocą RapidPlate.
  19. Inkubować w temperaturze 30°C przez 2 dni bez wytrząsania. Po 2 dniach na dnie każdej pomyślnie transformowanej studni powinny zacząć tworzyć się małe kolonie komórek.

3. Analiza kropelkowa (Spotting assay)

  1. Do każdego dołka nowej płytki 96-dołkowej o płaskim dnie nalać 200μL minimalnego podłoża opartego na rafinozie (np. SRaf/-Ura).
  2. Wymieszać zawartość każdego dołka na płytce transformacyjnej, ośmiokrotnie aspirując i dozując zawiesinę komórkową za pomocą Rapidplate.
  3. Zaszczepić płytki SRaf, przenosząc 5μL mieszaniny komórek z płytki transformacyjnej.
  4. Inkubować w temperaturze 30°C przez jeden dzień. Po jednym dniu na dnie każdego dołka powinny pojawić się małe kolonie.
  5. Przenieść kolonie na płytki SD/-Ura oraz SGal/-Ura w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zestaw do replikacji 96-dołkowej (frogger) wysterylizować przez opalanie płomieniem. Przed przeniesieniem na selektywne podłoża wymieszać kolonie za pomocą replikatora. Po przeniesieniu pozostawić płytki do wyschnięcia w komorze przez 5-10 minut.
  6. Inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 dni.

Wykonaj zdjęcia płytek za pomocą aparatu cyfrowego i wizualnie porównaj wzrost kolonii na płytkach SGal/-Ura, aby zidentyfikować kolonie, w których toksyczność szczepu badanego jest zwiększona (wolniejszy wzrost/mniej gęste kolonie) lub zredukowana (szybszy wzrost/bardziej gęste kolonie).

4. Reprezentatywne wyniki:

Test na mikropłytkach porównujący ekspresję TDP-43 w glukozie i galaktozie, podkreślający regulację genów.
Rysunek 1. Przesiewowe badanie nadekspresji plazmidowej u drożdży w celu identyfikacji supresorów i enhancerów toksyczności TDP-43. TDP-43 to ludzkie białko, które jest zaangażowane w patogenezę stwardnienia bocznego zanikowego (choroby Lou Gehriga). Cytoplazmatyczne agregaty TDP-43 gromadzą się w neuronach mózgu i rdzenia kręgowego pacjentów z ALS 17. Ekspresja TDP-43 w komórkach drożdży prowadzi do agregacji i cytotoksyczności 18. Wykorzystaliśmy ten model systemowy do zdefiniowania mechanizmów toksyczności TDP-43 19,20. Przedstawiono reprezentatywne przykłady płytek z naszego badania modyfikatorów toksyczności TDP-43 u drożdży. Płytki te zawierają kolonie z zintegrowanym plazmidem TDP-43 indukowanym galaktozą, które zostały również przekształcone plazmidami z biblioteki ekspresji ORF FLEXGene. Płytka po lewej zawiera glukozę, która represuje ekspresję TDP-43 lub plazmidów FLEXGene. Płytka po prawej zawiera galaktozę, która indukuje ekspresję TDP-43 oraz ORF w plazmidach FLEXGene. Zielona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który supresuje toksyczność TDP-43. Czerwona strzałka wskazuje kolonię przekształconą plazmidem, który wzmacnia toksyczność TDP-43.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania wysokoprzepustowego screeningu nadekspresji plazmidowej w drożdżach. Podejście to umożliwia szybki i bezstronny screening genetycznych modyfikatorów wielu różnych fenotypów komórkowych. Stosując tę metodę, badacz może przeanalizować znaczną część genomu drożdży w ciągu kilku tygodni. To bezstronne podejście pozwala również na identyfikację modyfikatorów, których nie można było przewidzieć na podstawie wcześniejszych odkryć. Wykorzystaliśmy tę metodę do ident...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant z Packard Center for ALS Research na Johns Hopkins (A.D.G.), NIH Director’s New Innovator Award 1DP2OD004417-01 (A.D.G), NIH R01 NS065317 (A.D.G.) oraz Rita Allen Foundation Scholar Award. A.D.G. jest stypendystą Pew Scholar in the Biomedical Sciences, wspieranym przez The Pew Charitable Trusts.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BioRobot RapidPlateQiagen9000490
96-dołkowy replikator (frogger)V&P ScientificVP404
Biblioteka ORF FLEXGeneInstitute of Proteomics, Harvard Medical School
Wirówka laboratoryjnaEppendorf5810R
Kolba z przegrodami 500mLBellco Glass2543-00500
Kolba Fernbacha z potrójnymi przegrodami 2.8LBellco Glass2551-02800
Napiwniki do pipet Rapidplate 100μLAxygen ScientificZT-100-R-S
Napiwniki do pipet Rapidplate 200μLAxygen ScientificZT-200-R-S

Bibliografia

  1. Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
  2. Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
  3. Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
  4. Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
  5. Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
  6. Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
  7. Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
  8. Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
  9. Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
  10. Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  11. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
  12. Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
  13. Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  14. Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
  15. Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  16. Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
  17. Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
  18. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
  19. Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
  20. Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
  21. Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  22. Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
  23. Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiew plazmidowy dro d ytransformacja wysokoprzepustowaSaccharomyces cerevisiaeprzesiewy genetycznerobot do pipetowaniatest plamkowybia ka podatne na agregacjanaliza funkcji gen wp ytki 96 do kowe
Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.