In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Podsumowanie

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

Streszczenie

Funkcjonalna charakterystyka genów eksprymowanych podczas rozwoju siatkówki ssaków nadal stanowi istotne wyzwanie. Targetowanie genów w celu generowania konstytutywnych lub warunkowych knockoutów z utratą funkcji pozostaje kosztowne, pracochłonne oraz czasochłonne. Dodatkowo, geny eksprymowane w siatkówce mogą pełnić kluczowe role poza nią, co prowadzi do niezamierzonych czynników zakłócających przy zastosowaniu podejścia knockout. Co więcej, możliwość ektopowej ekspresji genu w eksperymencie z zyskiem funkcji może być niezwykle wartościowa przy próbie zidentyfikowania jego roli w specyfikacji losu komórek i/lub różnicowaniu końcowym.

Przedstawiamy metodę szybkiej i wydajnej inkorporacji plazmidów DNA do siatkówki noworodka myszy za pomocą elektroporacji. Przyłożenie krótkich impulsów elektrycznych o natężeniu pola powyżej określonej wartości prowadzi do przejściowego wzrostu przepuszczalności błony plazmatycznej, co ułatwia transport materiału przez błonę ^1,2,3,4. Przełomowe prace wykazały, że elektroporacja może być wykorzystywana jako metoda transferu genów do komórek ssaków poprzez indukowanie powstawania hydrofilowych porów w błonie plazmatycznej, co umożliwia przejście silnie naładowanego DNA przez dwuwarstwę lipidową ⁵. Ciągły rozwój techniczny sprawił, że elektroporacja stała się możliwa do zastosowania jako metoda transferu genów in vivo w wielu tkankach myszy, w tym w siatkówce, a metoda ta została opisana w niniejszym opracowaniu ^{6, 7, 8, 9, 10}.

Roztwór DNA wstrzykuje się do przestrzeni podsiatkówkowej, tak aby DNA znalazło się pomiędzy nabłonkiem barwnikowym siatkówki a siatkówką noworodka myszy (P0), a następnie przy użyciu elektrody pęsetowej aplikuje się impulsy elektryczne. Boczne rozmieszczenie oczu u myszy umożliwia łatwą orientację elektrody pęsetowej w niezbędnym układzie: biegun ujemny-DNA-siatkówka-biegun dodatni. Szeroka inkorporacja i ekspresja przetransferowanych genów mogą być zidentyfikowane do 2. dnia po urodzeniu (P2). Ze względu na brak znaczącej migracji bocznej komórek w siatkówce, powstają obszary elektroporowane i nieelektroporowane. Obszary nieelektroporowane mogą, w zależności od potrzeb, służyć jako wewnętrzne kontrole histologiczne.

Elektroporacja siatkówki może być wykorzystana do ekspresji genu pod kontrolą promotora powszechnego, takiego jak CAG, lub do zaburzenia funkcji genu przy użyciu konstruktów shRNA lub rekombinazy Cre. Bardziej ukierunkowaną ekspresję można osiągnąć, projektując konstrukty z promotorami genów specyficznymi dla danej komórki. Wizualizację elektroporowanych komórek uzyskuje się za pomocą konstruktów bicistronicznych ekspresujących GFP lub poprzez współelektroporację konstruktu ekspresyjnego GFP. Ponadto można przeprowadzić elektroporację wielu konstruktów w celu badania kombinatorycznych efektów genetycznych lub jednoczesnego uzyskania funkcji (gain of function) i utraty funkcji (loss of function) różnych genów. Elektroporacja siatkówki może być również wykorzystana do analizy genomowych elementów cis-regulatorowych poprzez tworzenie odpowiednich konstruktów ekspresyjnych i mutantów z delecjami. Takie eksperymenty mogą służyć do identyfikacji regionów cis-regulatorowych wystarczających lub niezbędnych do specyficznej dla komórki ekspresji genu ¹¹. Potencjalne eksperymenty są ograniczone jedynie dostępnością konstruktów.

Protokół

1. Przygotowanie plazmidu do elektroporacji

Stężenie DNA wymagane do elektroporacji wynosi 5μg/μl. Zazwyczaj wymaga to amplifikacji pożądanych plazmidów przy użyciu metody Maxi-prep (Qiagen) lub równoważnej, a następnie oczyszczenia i zagęszczenia DNA do ilości roboczej. Poniższe kroki opisują przygotowanie DNA do ilości roboczej.

1. Odpowiedzieć 100 μg DNA (z Maxi-prep lub odpowiednika) i rozcieńczyć do objętości 100 μL w celu ułatwienia manipulacji.
2. Dodać fenol; ilość fenolu należy obliczyć tak, aby uzyskać stosunek DNA/objętość wynoszący około 60% (μg DNA:objętość całkowita), np.: 100 μg DNA (w 100 μL) plus 67 μL fenolu (100 μg:167 μL). Wymieszać dokładnie; nie pipetować w górę i w dół, ponieważ może to spowodować nadmierne ścinanie DNA.
3. Wirować DNA przez 5 minut przy 14000 RPM w temperaturze pokojowej.
4. Zebrać nadsącz i dodać chloroform, stosując ten sam stosunek DNA:objętość całkowita, co w kroku 1.2; wymieszać zgodnie z opisem w kroku 1.2 i wirować przy 14000 RPM przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Zebrać nadsącz, dodać do roztworu DNA octanu sodu 3 M w ilości stanowiącej 10% objętości nadsączu, delikatnie wymieszać, a następnie dodać 100% etanol w objętości 2,5 razy większej niż objętość nadsączu. Wymieszać przez odwracanie probówki. DNA powinno wytrącić się z roztworu podczas mieszania.
6. Wirować DNA w temperaturze 4°C przez 10 minut przy 14000 RPM.
7. Przepłukać 350 μl 70% etanolu, wirować przy 14000 RPM przez 5 minut w temperaturze 4°C.
8. Osuszyć osad na powietrzu, a następnie rozpuścić DNA w 1 X PBS (klasy biologii komórki) do stężenia 5μg/μL. Nie wysuszać próbki nadmiernie, ponieważ utrudni to jej rozpuszczenie w PBS.
9. Do roztworu DNA dodać barwnik Fast Green (stok 10%) tak, aby końcowe stężenie barwnika wynosiło 0,1%, aby pełnił on rolę znacznika wstrzyknięcia.

2. Iniekcja podsiatkówkowa DNA

Następne kroki wykonuje się przy pomocy stereomikroskopu. Po przećwiczeniu proces otwierania oka, nacięcia i iniekcji zajmuje mniej niż 1,5 minuty, co jest czasem zbyt krótkim, aby prawidłowo znieczulone szczenię odzyskało przytomność. Używając ostrej igły o rozmiarze 30G, ostrożnie otwórz oko, przecinając zrośnięty nabłonek połączenia (Rys. 1C). Nie przykładaj nadmiernej siły, ponieważ może to doprowadzić do przecięcia gałki ocznej. Unikaj nacinania poza obszarem połączenia powiek, gdyż spowoduje to krwawienie, które może utrudnić wykonanie iniekcji.

1. Zanurzyć noworodki myszy w lodzie na kilka minut w celu znieczulenia (Rys. 1A); nie należy zakopywać młodych w lodzie, ponieważ może to doprowadzić do ich śmierci. Czas ekspozycji na lód jest zmienny dla każdego osobnika; zazwyczaj wystarcza 5 minut, jednak należy uważnie monitorować myszy, gdyż niektóre mogą zareagować bardzo szybko, a inne mogą wymagać dłuższego czasu w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu znieczulenia. Sprawdzić odruch wycofania, wykonując ucisk łapy kleszczykami hemostatycznymi.
2. Aby umożliwić wstrzyknięcie DNA do przestrzeni podsiatkówkowej, należy najpierw otworzyć oko. Przetrzeć oko przeznaczone do iniekcji gazikiem nasączonym 70% alkoholem izopropylowym (Tyco healthcare) i zlokalizować zrośnięty nabłonek łączny w miejscu styku obu powiek (Rys. 1B).
3. Używając ostrej igły o rozmiarze 30G, ostrożnie otworzyć oko, wykonując nacięcie wzdłuż zrośniętego nabłonka łącznego (Rys. 1C). Nie należy używać nadmiernej siły, aby uniknąć przecięcia gałki ocznej. Należy unikać nacinania obszarów poza zakresem połączenia powiek, ponieważ spowoduje to krwawienie, które może utrudnić wykonanie iniekcji.
4. Aby ułatwić penetrację oka przez tępe igły do iniekcji, należy za pomocą czubka igły o rozmiarze 30G wykonać niewielkie nacięcie w twardówce w pobliżu jej połączenia z rogówką (Rys. 1E). Nie należy wprowadzać igły zbyt głęboko, aby nie przebić soczewki.
5. Pobrać 0.3 μl roztworu DNA do tępej igły do iniekcji o rozmiarze 33G, korzystając ze skali strzykawki do indywidualnego pomiaru objętości dla każdej iniekcji (średnica zewnętrzna igły 0.52 mm, średnica wewnętrzna 0.13 mm; mikrostrzykawka Exmire; Ito corp). Wprowadzić igłę do nacięcia, aż do momentu odczucia oporu przeciwległej ściany twardówki. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić soczewki podczas przechodzenia igły przez komorę witreoidalną (Rys. 2B).
6. Powoli wstrzyknąć 0.3 μl roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej, naciskając tłok strzykawki palcem wskazującym lub kciukiem. Eksperymentator musi precyzyjnie kontrolować szybkość dociskania tłoka, tak aby tempo wstrzykiwania roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej nie przekraczało tempa jego rozprzestrzeniania się w tej przestrzeni (Rys. 2C). Roztwór DNA jest lepki, dlatego ważne jest, aby nie dociskać igły zbyt mocno do przeciwległej ściany twardówki, gdyż może to uniemożliwić wstrzyknięcie DNA lub spowodować jego nierównomierne rozprowadzenie. Prawidłowo wykonana iniekcja skutkuje równomiernym rozprzestrzenieniem się roztworu DNA w części przestrzeni podsiatkówkowej. Podczas obracania zwierzęcia po iniekcji powinny być widoczne obszary siatkówki z zielonym znacznikiem oraz obszary go pozbawione.

3. Elektroporacja

1. Elektroporację przeprowadza się przy użyciu elektrody pęsetowej o średnicy 10 mm (Model #522; BTX Instruments). Elektrodę pęsetową należy namoczyć w PBS w celu zmaksymalizowania przewodnictwa elektrycznego między elektrodą a zwierzęciem, a następnie umieścić głowę wstrzykniętego szczenięcia między elektrodami tak, aby wstrzyknięte oko znajdowało się obok elektrody dodatniej, a oko niewstrzyknięte obok elektrody ujemnej (Rys. 3B).
2. Za pomocą generatora impulsów należy przyłożyć pięć impulsów prostokątnych: każdy impuls ma napięcie 80 V i czas trwania 50 ms, z odstępem 950 ms między impulsami.
3. Elektroporowane szczenięta należy teraz ogrzewać do czasu wybudzenia z anestezji lodowej. Można to zrobić, umieszczając szczenięta pod lampą grzewczą lub na podgrzewaczu do szkiełek. W przypadku korzystania z podgrzewacza do szkiełek należy upewnić się, że między metalową powierzchnią a budzącym się szczenięciem znajduje się odpowiednia podkładka. Po wybudzeniu należy zwrócić elektroporowane szczenięta matce.

4. Przygotowanie oczu do analizy

1. Czas pobrania i analizy elektroporowanych siatkówek zależy od celów eksperymentu. Ekspresję GFP można zwizualizować w sposób ogólny 3 dni po elektroporacji. W celu zamrożenia w medium i wykonania przekrojów należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
2. Uśmiercić elektroporowane zwierzęta w wybranym punkcie czasowym. Wypreparować elektroporowane oko i utrwalić w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4°C przez 50 minut.
3. Ostrożnie usunąć siatkówkę z oka poprzez mikrodysekcję twardówki, rogówki, soczewki, naczyniówki oraz nabłonka pigmentowego siatkówki. Wypreparowane siatkówki można poddać analizie fluorescencyjnej w celu ogólnego określenia wydajności elektroporacji. Przenieść siatkówki do 30% roztworu sacharozy na noc w temperaturze 4°C.
4. Zamrozić siatkówki w medium do kriotomii O.C.T. (Sakura Finetek USA) i przechowywać w temperaturze -80°C. Siatkówki można teraz pociąć na kriotomie i nanieść na szkiełka przedmiotowe.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady siatkówek noworodków P0 poddanych elektroporacji plazmidem ekspresyjnym pCAG-EGFP przedstawiono na rysunku 4 w 3. dniu po elektroporacji (P3) oraz w 14. dniu po elektroporacji (P14). Obszar tkanki siatkówki poddanej elektroporacji jest zmienny w zależności od eksperymentu, co zależy od zakresu uszkodzeń tkanki powstałych podczas wstrzykiwania oraz równomierności rozprzestrzeniania się roztworu DNA w przestrzeni podsiatkówkowej. Zazwyczaj w 90-100% elektroporowanych siatkówek występują komórki, które skutecznie włączyły i wyekspresowały wprowadzony plazmid. Jednakże, uwzględniając morfologię tkanki i wydajność elektroporacji, tylko 40-60% elektroporowanych siatkówek nadaje się do analizy porównawczej. W miejscu penetracji igły niemal zawsze obserwuje się tworzenie rozet i odwarstwienie siatkówki; obszar ten nie powinien być wykorzystywany do analizy. Prawidłowe rozprzestrzenienie się DNA podczas mikroiniekcji skutkuje efektywną elektroporacją tkanki bocznie względem miejsca penetracji igły, która jest wolna od rozet i odwarstwień. Gliosis jest również istotnym problemem eksperymentalnym i niemal zawsze występuje w miejscu penetracji igły. Jednak, podobnie jak w przypadku tworzenia rozet i odwarstwienia siatkówki, gliosis zazwyczaj nie jest znacząca w tkance poddanej elektroporacji bocznej. Do określenia, czy poziom reaktywnej gliozy w analizowanych obszarach mieści się w dopuszczalnych progach, można wykorzystać markery immunohistochemiczne, takie jak gliałkowe kwaśne białko włókniste (GFAP). Przedstawiono przekroje siatkówek wykazujące, że morfologia elektroporowanej siatkówki pozostaje nienaruszona, a ekspresja EGFP znakuje poszczególne elektroporowane komórki. Zaprezentowano przykłady 3 dni po elektroporacji P0 (Rys. 4A-C) oraz 14 dni po elektroporacji P0 (Rys. 4D-F).

W siatkówkach P3 większość elektroporowanych komórek znajduje się w warstwie neuroblastycznej (NBL) siatkówki i nie wykazuje wyraźnych cech morfologicznych żadnej z zróżnicowanych komórek neuronalnych lub glejowych siatkówki (Ryc. 4B, C). Do P14 elektroporowane komórki można znaleźć w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL) oraz wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) siatkówki. Co więcej, różne znakowane komórki wykazują obecnie charakterystyczne cechy morfologiczne zróżnicowanych neuronów, w tym interneurony INL, fotoreceptory oraz glej Müllera (Ryc. 4E, F).

Rycina 1. Znieczulenie noworodka (P0) myszy i otwarcie oka w celu podania podsiatkówkowego zastrzyku z roztworem DNA. A) Noworodek umieszczony na warstwie kruszonego lodu w celu znieczulenia. Oko, w które zostanie wykonany zastrzyk, jest skierowane w dół, w stronę lodu. B) Lokalizacja zrośniętego nabłonka połączeniowego (B, strzałka) powiek, które należy rozciąć w celu otwarcia oka. C) Rozcięcie powiek wzdłuż zrośniętego nabłonka połączeniowego (C, strzałka) w celu odsłonięcia oka. D) Otwarte oko po rozcięciu w miejscu zrostu. E) W twardówce oka, pod rogówką, wykonuje się nacięcie, aby ułatwić wprowadzenie tępej strzykawki do mikroiniekcji. Paski skali, B, C, D, E: 4mm.

Rysunek 2. Wprowadzenie tępokątowej strzykawki do mikroiniekcji i wstrzykiwanie roztworu plazmidu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej. A) Schemat ilustrujący prawidłowe wprowadzenie strzykawki do mikroiniekcji do oka i umieszczenie końcówki strzykawki w przestrzeni podsiatkówkowej. Wstrzyknięcie roztworu DNA do komory ciała szklistego, przejście strzykawki przez oko do oczodołu lub iniekcja do soczewki spowodują niepowodzenie eksperymentów i obecność niewielkiej liczby lub całkowity brak komórek elektroporowanych. B) Przebicie strzykawką nacięcia wykonanego w ścianie twardówki i umieszczenie końcówki strzykawki w przestrzeni podsiatkówkowej. C) Iniekcja roztworu DNA do przestrzeni podsiatkówkowej. Paski skali, B, C: 4mm. Skróty: R-siatkówka, L-soczewka, V-ciało szkliste, SrS-przestrzeń podsiatkówkowa, BES-tępokątna strzykawka.

Rysunek 3. Orientacja elektrody pęsetowej na myszy do elektroporacji. A) Schemat ilustrujący orientację dodatniej i ujemnej łopatki elektrody pęsetowej względem oka poddanego elektroporacji. Kolor zielony oznacza miejsce wstrzyknięcia DNA do przestrzeni podsiatkówkowej. Przerywane strzałki reprezentują ruch elektroforetyczny ujemnie naładowanego wstrzykniętego DNA w kierunku elektrody dodatniej. Elektroforeza DNA zachodzi z przestrzeni podsiatkówkowej przylegającej do elektrody ujemnej w stronę siatkówki zorientowanej w kierunku elektrody dodatniej. B) Dodatnia łopatka pęsety jest umieszczona obok oka, do którego mikroiniekcyjnie podano DNA, a łopatka ujemna obok oka niepoddanego iniekcji. C) Obraz przy dużym powiększeniu pokazujący rozmieszczenie elektrody pęsetowej na noworodkowej myszy. Linie przerywane reprezentują kierunek ruchu elektroforetycznego DNA w stronę elektrody dodatniej. Pasek skali, C: 5mm.

Rycina 4. Siatkówki noworodków myszy (P0) poddane elektroporacji pCAG-EGFP i analizowane w 3. dniu po urodzeniu (P3) oraz 14. dniu po urodzeniu (P14). A-C) Obrazy konfokalne przekroju siatkówki P3 poddanej elektroporacji pCAG-EGFP w dniu P0. Większość elektroporowanych komórek znajduje się w neuroblastycznej warstwie siatkówki (NBL). (D-F) Obrazy konfokalne przekroju siatkówki P14 poddanej elektroporacji pCAG-EGFP w dniu P0. Elektroporowane komórki można zidentyfikować w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL) oraz wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) siatkówki. Paski skali, A-F: 50 μm.

Dyskusja

In vivo elektroporacja stanowi szybką i wydajną metodę transformacji komórek siatkówki za pomocą plazmidów ekspresyjnych DNA. Metoda ta pozwala badaczowi na przeprowadzenie badań nad uzyskaniem funkcji (gain of function) poprzez ektopową wprowadzenie genu zainteresowania pod kontrolą powszechnie eksponowanego promotora lub na przeprowadzenie badań nad utratą funkcji (loss of function) z wykorzystaniem konstruktów shRNA celujących w interesujące geny. Ponadto, jednocześnie można elektroporować wiele plazmidów DNA...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fenol nasycony buforem	Invitrogen	15513-039	N/A
Chloroform	JT Baker	9180-03	N/A
Octan sodu	JT Baker	3470-05	stok 3 M
Fast Green FCF	Fisher Scientific	BP123-10	stok 10 %
Preparat alkoholu izopropylowego	Tyco Healthcare, Covidien	6918	N/A
Igła 30G	Terumo Medical Corp.	SG2-3013	N/A
Mikrosstrzykawka Exmire	Ito Corporation	MS*E05	N/A
Tweezertrode (elektroda szczypcowa)	BTX Technologies	522	N/A
Electro Square Porator (elektroporator)	BTX Technologies	ECM 830	N/A
Związek O.C.T.	Sakura Finetek	4583	N/A