Środowiskowy bakterioplankton inkubuje się z modelowym związkiem rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) oraz odczynnikiem do znakowania DNA, bromodeoksyurydyną (BrdU). Następnie komórki degradujące DOC oddziela się od całej populacji na podstawie zwiększonego wbudowania BrdU przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Komórki te są następnie identyfikowane za pomocą późniejszych analiz molekularnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroby są głównymi czynnikami pośredniczącymi w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) w środowiskach wodnych. Jednakże identyfikacja taksonów bakteryjnych, które przekształcają konkretne pulle DOC w naturze, stanowi wyzwanie techniczne.
W niniejszej pracy opisujemy podejście łączące wbudowywanie bromodeoksyurydyny (BrdU), fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) oraz analizę molekularną opartą na genie 16S rRNA, co pozwala na niezależną od hodowli identyfikację bakterioplanktonu zdolnego do degradacji konkretnego związku DOC w środowiskach wodnych. Ustawia się potrójne mikrokosmosy bakterioplanktonu, do których dodaje się zarówno BrdU, jak i modelowy związek DOC (suplementacja DOC), lub tylko BrdU (kontrola bez dodatku). BrdU zastępuje tymidynę w nowo syntetyzowanym bakteryjnym DNA, a znakowane BrdU DNA można łatwo wykryć immunologicznie 1,2. Zakłada się, że podczas 24-godzinnej inkubacji bakterioplankton zdolny do wykorzystania dodanego związku DOC zostanie selektywnie aktywowany, a w konsekwencji wykaże wyższy poziom wbudowania BrdU (komórki HI) niż komórki niewrażliwe w próbkach z suplementacją DOC oraz komórki w kontrolach bez dodatku (komórki o niskim wbudowaniu BrdU, komórki LI). Po fluorescencyjnej immunodetekcji komórki HI zostają odróżnione i fizycznie odseparowane od komórek LI za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) 3. Z posortowanych komórek wrażliwych na DOC (komórki HI) ekstrahuje się DNA, a następnie identyfikuje je taksonomicznie poprzez analizy oparte na genie 16S rRNA, obejmujące PCR, konstrukcję biblioteki klonów oraz sekwencjonowanie.
Protokół
1. Przetwarzanie próbek wody
- Przefiltruj 10L wody środowiskowej przez filtry membranowe o wielkości porów 1 μm w celu usunięcia dużych cząstek oraz bakteriożerców. Zbierz przefiltrowaną wodę do gąsiorka.
- Przenieś po 36 ml filtratu do 3 sterylnych probówek Eppendorf (50 ml) zawierających 4 ml świeżo przygotowanego roztworu paraformaldehydu (PFA; 10%). Inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Zbierz komórki na białych filtrach membranowych o wielkości porów 0,2 μm za pomocą filtracji próżniowej. Przemyj filtr, przepuszczając przez niego 10 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) metodą filtracji próżniowej.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasze podejście łączy wbudowywanie BrdU, FACS oraz analizę 16S rDNA, co pozwala na identyfikację na poziomie gatunkowym bakterioplanktonu metabolizującego poszczególne komponenty DOC w środowiskach wodnych. Test wbudowywania BrdU znakuje komórki bakteryjne na podstawie aktywności metabolicznej, co umożliwia analizę wyłącznie aktywnych bakterii i tym samym wyklucza komórki w stanie uśpienia. W naszym podejściu wbudowywanie BrdU jest wykrywane immunologicznie in situ, a bakterie o różnych poziomach wbudowania BrdU.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez granty Narodowej Fundacji Nauki (National Science Foundation) OCE1029607 (dla X.M.) oraz MCB0702125 (dla M.A.M.) a także przez Fundację Gordona i Betty Moore (dla M.A.M.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| BrdU | Odczynnik | Sigma-Aldrich | B5002-5G | |
| Lizozym | Odczynnik | Sigma-Aldrich | L6876-5G | |
| Proteinaza K | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P2308-25MG | |
| Zestaw do badania proliferacji komórek in situ, FLUOS | Zestaw | Roche Group | 11810740001 | Zużyć więcej przeciwciała Anti-BrdU-FLUOS oraz buforu inkubacyjnego na jedną reakcję, niż sugeruje producent. |
| Komory inkubacyjne Frame-Seal | Materiał | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 142 mm, rozmiar porów 1,0 μm) | Materiał | EMD Millipore | FALP14250 | |
| Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 25 mm, rozmiar porów 0,2 μm) | Materiał | EMD Millipore | FGLP02500 | |
| Kuleczki do PCR illustra PuReTaq Ready-To-Go | Zestaw | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| Zestaw do oczyszczania DNA z żelu QIAquick | Zestaw | Qiagen | 28704 | |
| System PCR FailSafe | Zestaw | Epicentre Biotechnologies | FS99060 |
Bibliografia
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
