Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Podsumowanie

Środowiskowy bakterioplankton inkubuje się z modelowym związkiem rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) oraz odczynnikiem do znakowania DNA, bromodeoksyurydyną (BrdU). Następnie komórki degradujące DOC oddziela się od całej populacji na podstawie zwiększonego wbudowania BrdU przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Komórki te są następnie identyfikowane za pomocą późniejszych analiz molekularnych.

Streszczenie

Mikroby są głównymi czynnikami pośredniczącymi w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) w środowiskach wodnych. Jednakże identyfikacja taksonów bakteryjnych, które przekształcają konkretne pulle DOC w naturze, stanowi wyzwanie techniczne.

W niniejszej pracy opisujemy podejście łączące wbudowywanie bromodeoksyurydyny (BrdU), fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) oraz analizę molekularną opartą na genie 16S rRNA, co pozwala na niezależną od hodowli identyfikację bakterioplanktonu zdolnego do degradacji konkretnego związku DOC w środowiskach wodnych. Ustawia się potrójne mikrokosmosy bakterioplanktonu, do których dodaje się zarówno BrdU, jak i modelowy związek DOC (suplementacja DOC), lub tylko BrdU (kontrola bez dodatku). BrdU zastępuje tymidynę w nowo syntetyzowanym bakteryjnym DNA, a znakowane BrdU DNA można łatwo wykryć immunologicznie ^1,2. Zakłada się, że podczas 24-godzinnej inkubacji bakterioplankton zdolny do wykorzystania dodanego związku DOC zostanie selektywnie aktywowany, a w konsekwencji wykaże wyższy poziom wbudowania BrdU (komórki HI) niż komórki niewrażliwe w próbkach z suplementacją DOC oraz komórki w kontrolach bez dodatku (komórki o niskim wbudowaniu BrdU, komórki LI). Po fluorescencyjnej immunodetekcji komórki HI zostają odróżnione i fizycznie odseparowane od komórek LI za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) ³. Z posortowanych komórek wrażliwych na DOC (komórki HI) ekstrahuje się DNA, a następnie identyfikuje je taksonomicznie poprzez analizy oparte na genie 16S rRNA, obejmujące PCR, konstrukcję biblioteki klonów oraz sekwencjonowanie.

Protokół

1. Przetwarzanie próbek wody

1. Przefiltruj 10L wody środowiskowej przez filtry membranowe o wielkości porów 1 μm w celu usunięcia dużych cząstek oraz bakteriożerców. Zbierz przefiltrowaną wodę do gąsiorka.
2. Przenieś po 36 ml filtratu do 3 sterylnych probówek Eppendorf (50 ml) zawierających 4 ml świeżo przygotowanego roztworu paraformaldehydu (PFA; 10%). Inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Zbierz komórki na białych filtrach membranowych o wielkości porów 0,2 μm za pomocą filtracji próżniowej. Przemyj filtr, przepuszczając przez niego 10 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) metodą filtracji próżniowej. Oznacz filtry jako kontrole negatywne i przechowuj je w temperaturze -20°C.

Kroki 1.3-1.4 są opcjonalne w celu ustanowienia warunków ograniczenia DOC.

3. Do gąsiora dodać mieszaninę nieorganicznego azotu i fosforu (stężenie końcowe 5 μM NH₄Cl, 5 μM NaNO₃ oraz 1μM NaH₂PO₄).
4. Inkubować w ciemności w temperaturze in situ przez 48 godzin, okazjonalnie mieszając zawiesinę.

2. Tworzenie i inkubacja mikrokosmosów

1. Napełnij sześć szklanych kolb o pojemności 1 L próbką wody (po 80 ml) z gąsiora z kroku 1.4, aby utworzyć mikrokosmosy. Do każdego mikrokosmosu dodaj BrdU (stężenie końcowe 10 μM). Wymieszaj dokładnie.
2. Do trzech mikrokosmosów dodaj 1 ml roztworu modelowego związku DOC; będą one służyć jako próbki z dodatkiem DOC. Do pozostałych trzech mikrokosmosów dodaj 1 ml sterylnego PBS; będą one służyć jako kontrole bez dodatków.
3. Wszystkie mikrokosmosy inkubuj w inkubatorze z wytrząsarką w ciemności, w temperaturze in situ, przy prędkości wytrząsania 10 rpm.
4. Pobierz 36 ml próbki wody z każdego mikrokosmosu i przenieś do sterylnych probówek Eppendorf o pojemności 50 ml w punktach czasowych 0, 8, 16 i 24 godziny. Natychmiast dodaj 4 ml świeżego PFA (10%) do probówek z pobranymi próbkami i inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki.
5. Przefiltruj utrwalone komórki przez membrany poliwęglanowe o rozmiarze porów 0,2 μm. Przepłucz filtry 10 ml PBS. Przejdź niezwłocznie do następnego kroku lub przechowuj filtry w temperaturze -20°C.

3. Immunodetekcja in situ wbudowania BrdU

1. Rozmrozić filtry (próbki z dodatkiem DOC, kontrole bez dodatków oraz kontrole negatywne) w temperaturze pokojowej.
2. Nanieść 1 ml roztworu lizozymu [10 mg/ml lizozymu z białka jaja w 10 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] ⁴, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.
3. Nanieść 1 ml roztworu proteinazy K [2 mg/ml proteinazy K w 10 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] ⁴, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.
4. Nanieść 1 ml roztworu egzonukleazy [egzonukleaza III (50 U/ml) w 5 mM MgCl₂ i 50 mM Tris-HCl] ⁵, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przemyć filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.
5. Złożyć komory inkubacyjne z uszczelką ramową (Bio-Rad) zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Podzielić filtr na ósemki za pomocą sterylnego ostrza na suchej powierzchni oczyszczonej alkoholem.
7. Używając pęsety, umieścić jedną ósmą część filtra w jednej złożonej komorze inkubacyjnej z uszczelką ramową (dla każdej próbki filtra wymaganych jest osiem komór). Strona fragmentu filtra zawierająca komórki powinna być skierowana do góry. Wilgotność na spodzie filtra pozwoli mu przywrzeć do szkiełka. Jeśli filtr wyschnie, przed umieszczeniem fragmentu filtra na szkiełku nanieść małą kroplę (2 μl) diH₂O na środek komory.

W krokach 3.8-3.20 zastosowano odczynniki z zestawu ROCHE In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS, zgodnie z procedurami zmodyfikowanymi względem instrukcji producenta. Z wyjątkiem PBS, wszystkie odczynniki są dostarczone w zestawie.

8. Nanieś odpowiednią ilość buforu inkubacyjnego (0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Tween20 w PBS), aby równomiernie pokryć cały odcinek filtra w komorze inkubacyjnej, tak aby po nałożeniu uszczelnienia nie doszło do przelewania.
9. Nałóż poliestrową pokrywkę na ramkę komory inkubacyjnej. Dociśnij, aby szczelnie zamknąć komorę. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza nad filtrem. Inkubuj zamknięte komory przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
10. Zdejmij poliestrową uszczelkę i otwórz komory inkubacyjne. (Uwaga: otwieranie komór może czasami spowodować oderwanie uszczelki ramki od szkiełka. W takim przypadku należy przygotować nową komorę do kolejnych etapów).
11. Odpipetuj bufor inkubacyjny z jednego narożnika komory. Unikaj kontaktu z filtrem.
12. Przemyj filtr, delikatnie pipetując 10 μl PBS do wnętrza komory i z powrotem, powtarzając tę czynność 3 razy.
13. Przygotuj roztwór roboczy przeciwciał anti-BrdU-FLUOS zgodnie z zaleceniami producenta bezpośrednio przed użyciem.
14. Nanieś 120 μl roztworu roboczego anti-BrdU-FLUOS na filtr, dbając o równomierne pokrycie całej powierzchni.
15. Ponownie zamknij komorę nową poliestrową pokrywką. Unikaj pęcherzyków powietrza nad filtrem. Inkubuj komorę w ciemności w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Ten etap pozwoli na znakowanie wbudowanego DNA BrdU in situ izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC).
16. Zdejmij poliestrową pokrywkę i otwórz komorę inkubacyjną. Odpipetuj roztwór roboczy anti-BrdU-FLUOS. Przemyj filtr 3 razy za pomocą PBS.
17. Przenieś filtr z komory inkubacyjnej na sterylną powierzchnię. Pokrój odcinek filtra na małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza.
18. Przenieś kawałki filtra do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, z których każda zawiera 1 ml PBS. Szczelnie zamknij probówkę i zabezpiecz parafilmem. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 20 rpm przez 10 min.
19. Umieść probówki w wibratorze typu vortex i mieszaj z maksymalną prędkością przez 5 minut. Odpipetuj nadsącz do sterylnej probówki Eppendorf o pojemności 15 ml. Powtórz etapy inkubacji i vortexowania jeszcze 5 razy. Połącz nadsącz w tej samej probówce Eppendorf 15 ml dla każdej próbki. Zazwyczaj w zawiesinie można odzyskać 80% komórek.
20. Przechowuj nadsącz z resuspendTime komórkami w temperaturze 4 °C. Sortuj w ciągu 2 dni.

4. Analiza FACS

W niniejszym rozdziale opisano procedurę dla cytometru przepływowego BD FACSAria oraz odpowiadającego mu oprogramowania.

1. Zoptymalizować ustawienia cytometru przepływowego zgodnie z zaleceniami producenta. Obejmuje to: regulację kontroli wzmocnienia w celu ustawienia wymaganych parametrów breakoff oraz tzw. sweet spot; optymalizację opóźnienia laserowego i czynników skalowania obszaru dla ciśnienia osłonki eksperymentalnej oraz optymalizację ustawień napięć FSC i SSC, progu FSC, skalowania fluorescencji FSC, napięć PMT fluorescencji itp.
2. Przeanalizować próbki kontrolne negatywne na cytometrze przepływowym (FCM) w oparciu o intensywność fluorescencji FITC i rozpraszanie boczne (SSC). Zwiększać próg FITC do momentu, aż na wyświetlaczu akwizycji FITC-SSC nie będą widoczne żadne komórki z kontroli negatywnych.
3. Przeanalizować próbki kontrolne bez dodatków i zbadać wzorzec rozkładu 10 0 komórek na podstawie akwizycji FITC i SSC. Zdefiniować bramkę obejmującą wszystkie komórki i oznaczyć je jako „komórki o niskiej intensywności” (LIs).
4. Przeanalizować próbki z dodatkiem DOC i zbadać wzorzec rozkładu 10 0 komórek na podstawie FITC i SSC. Część komórek pojawi się w uprzednio zdefiniowanej bramce LI. Zdefiniować kolejną bramkę obejmującą komórki o wyższej intensywności fluorescencji (HIs) niż LIs. Pozyskać statystyki, aby ocenić względną liczebność komórek w bramkach.
5. Posortować komórki HI do probówek kolekcjonujących zawierających 50 μl PBS w trybie „purify 1 drop”. Przerwać sortowanie, gdy liczba komórek HI osiągnie 50 0 zliczeń.

5. Filtrowanie amplifikacji PCR genów 16S rRNA

Procedury PCR z filtrowaniem zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Kirchman i wsp. ⁶

1. Przefiltruj posortowane komórki na biały filtr membranowy z poliwęglanu o rozmiarze porów 0,2 μm i średnicy 25 mm. Odetnij sterylnym ostrzem krawędź filtra, na której nie znajdują się komórki bakteryjne. Podziel filtr na 8 równych części.
2. Umieść pojedynczy fragment filtra w probówce do reakcji PCR, tak aby komórki były skierowane do wnętrza probówki. Dodaj do probówki 45 μl wody klasy PCR. Całkowicie zanurz filtr w wodzie.
3. Dodaj do probówki z reakcją PCR 2 kuleczki ROCHE illustra PuReTaq Read-To-Go PCR Beads i krótko wymieszaj na wortexie. Do każdej probówki dodaj po 2 μl starterów forward i reverse genu 16S rRNA (końcowe stężenie każdego startera 0,4 μM), takich jak 27F i 1492R ⁷.
4. (Opcjonalnie) Dodaj do mieszaniny reakcyjnej PCR 1 μl roztworu albuminy surowiczej bydlęcej (BSA, stężenie końcowe 30 μg/10 μl), aby pomóc w adsorpcji inhibitorów amplifikacji. W przypadku rezygnacji z dodania BSA, dodaj zamiast tego 1 μl wody.
5. Przeprowadź amplifikację PCR w termocyklerze. Zaleca się program touch down PCR, w którym temperatura przyłączania stopniowo spada od 62 do 52°C o 1°C na cykl przez 11 cykli, a następnie następuje 15 cykli z temperaturą przyłączania 52°C. Wszystkie cykle obejmują etapy denaturacji (w 95°C), przyłączania (od 62 do 52°C) i elongacji (w 72°C) o czasie trwania 50 s. Program PCR obejmuje również wstępną denaturację przez 3 min oraz końcową elongację przez 10 min.
6. Potwierdź amplifikację PCR za pomocą elektroforezy na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wytnij amplikony PCR z żelu i oczyść je za pomocą zestawu QIAGEN QIAquick gel extraction kit.
7. Przeprowadź dwie dodatkowe amplifikacje PCR dla każdej próbki, za każdym razem używając nowej części filtra. Po oczyszczeniu produktów PCR z żelu, połącz amplikony z tej samej próbki. Oczyszczone amplikony 16S rDNA są teraz gotowe do szeregu analiz molekularnych umożliwiających identyfikację taksonomiczną, takich jak konstrukcja biblioteki klonów i sekwencjonowanie.

6. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywne wyniki opisano na przykładzie badania bakterii degradujących putrescynę. Próbki wody pobrano z obszaru przybrzeżnego stanu Georgia i przetworzono zgodnie z opisanymi powyżej procedurami. Analiza FACS wykazała, że dodatek putrescyny indukuje rozwój grupy bakterii o wysokiej intensywności fluorescencji FITC, co wskazuje na wysoką stopień wbudowania BrdU (Rysunek 1). Komórki te określono jako komórki o wysokim poziomie wbudowania BrdU (HIs), które prawdopodobnie zawierają głównie bakterie degradujące putrescynę. Komórki HIs nie występowały w kontrolach bez dodatku, w których znajdowały się jedynie komórki o niższym poziomie wbudowania BrdU (LIs). Przewidywano, że LIs zawierają głównie bakterioplankton niezdolny do wykorzystania dodanej putrescyny. Komórki HIs posortowano do oddzielnych probówek, a następnie zebrano na filtry membranowe. Amplikony genu 16S rRNA dla komórek HI uzyskano za pomocą metody filter PCR.

Rycina 1. Analiza cytometryczna w przepływie próbek kontrolnych bez dodatków oraz próbek z dodatkiem związku modelowego (w tym przykładzie putrescyny), pobranych po 24 h inkubacji. Analiza rozkładu komórek opierała się na (1) intensywności fluorescencji znakowania FITC (oś X), która jest dodatnio skorelowana z poziomem wbudowania BrdU, oraz (2) rozproszeniu bocznym (SSC, oś Y), które jest dodatnio skorelowane z wielkością komórek. Oznaczenia bram oparto na poziomie wbudowania BrdU (HI – wysokie wbudowanie BrdU; LI – niskie wbudowanie BrdU). W odpowiednich bramach przedstawiono względny procent komórek HI i LI.

Dyskusja

Nasze podejście łączy wbudowywanie BrdU, FACS oraz analizę 16S rDNA, co pozwala na identyfikację na poziomie gatunkowym bakterioplanktonu metabolizującego poszczególne komponenty DOC w środowiskach wodnych. Test wbudowywania BrdU znakuje komórki bakteryjne na podstawie aktywności metabolicznej, co umożliwia analizę wyłącznie aktywnych bakterii i tym samym wyklucza komórki w stanie uśpienia. W naszym podejściu wbudowywanie BrdU jest wykrywane immunologicznie in situ, a bakterie o różnych poziomach wbudowania BrdU...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BrdU	Odczynnik	Sigma-Aldrich	B5002-5G
Lizozym	Odczynnik	Sigma-Aldrich	L6876-5G
Proteinaza K	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P2308-25MG
Zestaw do badania proliferacji komórek in situ, FLUOS	Zestaw	Roche Group	11810740001	Zużyć więcej przeciwciała Anti-BrdU-FLUOS oraz buforu inkubacyjnego na jedną reakcję, niż sugeruje producent.
Komory inkubacyjne Frame-Seal	Materiał	Bio-Rad	SLF-1201
Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 142 mm, rozmiar porów 1,0 μm)	Materiał	EMD Millipore	FALP14250
Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 25 mm, rozmiar porów 0,2 μm)	Materiał	EMD Millipore	FGLP02500
Kuleczki do PCR illustra PuReTaq Ready-To-Go	Zestaw	GE Healthcare	27-9559-01
Zestaw do oczyszczania DNA z żelu QIAquick	Zestaw	Qiagen	28704
System PCR FailSafe	Zestaw	Epicentre Biotechnologies	FS99060