Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Podsumowanie

Środowiskowy bakterioplankton inkubuje się z modelowym związkiem rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) oraz odczynnikiem do znakowania DNA, bromodeoksyurydyną (BrdU). Następnie komórki degradujące DOC oddziela się od całej populacji na podstawie zwiększonego wbudowania BrdU przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Komórki te są następnie identyfikowane za pomocą późniejszych analiz molekularnych.

Streszczenie

Mikroby są głównymi czynnikami pośredniczącymi w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) w środowiskach wodnych. Jednakże identyfikacja taksonów bakteryjnych, które przekształcają konkretne pulle DOC w naturze, stanowi wyzwanie techniczne.

W niniejszej pracy opisujemy podejście łączące wbudowywanie bromodeoksyurydyny (BrdU), fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) oraz analizę molekularną opartą na genie 16S rRNA, co pozwala na niezależną od hodowli identyfikację bakterioplanktonu zdolnego do degradacji konkretnego związku DOC w środowiskach wodnych. Ustawia się potrójne mikrokosmosy bakterioplanktonu, do których dodaje się zarówno BrdU, jak i modelowy związek DOC (suplementacja DOC), lub tylko BrdU (kontrola bez dodatku). BrdU zastępuje tymidynę w nowo syntetyzowanym bakteryjnym DNA, a znakowane BrdU DNA można łatwo wykryć immunologicznie ^1,2. Zakłada się, że podczas 24-godzinnej inkubacji bakterioplankton zdolny do wykorzystania dodanego związku DOC zostanie selektywnie aktywowany, a w konsekwencji wykaże wyższy poziom wbudowania BrdU (komórki HI) niż komórki niewrażliwe w próbkach z suplementacją DOC oraz komórki w kontrolach bez dodatku (komórki o niskim wbudowaniu BrdU, komórki LI). Po fluorescencyjnej immunodetekcji komórki HI zostają odróżnione i fizycznie odseparowane od komórek LI za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) ³. Z posortowanych komórek wrażliwych na DOC (komórki HI) ekstrahuje się DNA, a następnie identyfikuje je taksonomicznie poprzez analizy oparte na genie 16S rRNA, obejmujące PCR, konstrukcję biblioteki klonów oraz sekwencjonowanie.

Protokół

1. Obróbka próbki wody

1. Przefiltrować 10L wody środowiskowej przez filtry membranowe o rozmiarze porów 1 μm w celu usunięcia dużych cząstek i bakteriofagów. Zebrać filtrat wody do gąsiora.
2. Przenieść po 36 ml filtratu do 3 sterylnych probówek Eppendorfa (50 ml) zawierających 4 ml świeżo przygotowanego roztworu paraformaldehydu (PFA; 10%). Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Zebrać komórki na białych filtrach membranowych o rozmiarze porów 0,22 μm za pomocą filtracji próżniowej. Przepłukać filtr, przepuszczając przez niego 10 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) metodą filtracji próżniowej. Oznaczyć filtry jako kontrole negatywne i przechowywać je w temperaturze -20°C.

Kroki 1.3-1.4 są opcjonalne w celu ustanowienia warunków ograniczenia DOC.

3. Do baniaka dodać mieszaninę nieorganicznego azotu i fosforu (stężenie końcowe 5 μM NH₄Cl, 5 μM NaNO₃ oraz 1μM NaH₂PO₄).
4. Inkubować w ciemności w temperaturze in situ przez 48 godzin, okresowo wstrząsając naczyniom.

2. Tworzenie i inkubacja mikrokosmosów

1. Napełnij sześć 1-litrowych kolb szklanych objętością 800 ml próbki wody z gąsiora z kroku 1.4 w celu utworzenia mikrokosmosów. Do każdego mikrokosmosu dodaj BrdU (stężenie końcowe 10 μM). Wymieszaj dokładnie.
2. Do trzech mikrokosmosów dodaj 1 ml roztworu modelowego związku DOC; będą one służyć jako próbki z dodatkiem DOC. Do pozostałych trzech mikrokosmosów dodaj 1 ml sterylnego PBS; będą one służyć jako kontrole bez dodatków.
3. Wszystkie mikrokosmosy inkubuj w inkubatorze z wytrząsarką, w ciemności, w temperaturze in situ, przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm.
4. Pobierz 36 ml próbki wody z każdego mikrokosmosu i przenieś do sterylnych probówek Eppendorf o pojemności 50 ml w punktach czasowych 0, 8, 16 i 24 godziny. Natychmiast dodaj 4 ml świeżego PFA (10%) do probówek z próbkami i inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek.
5. Przefiltruj utrwalone komórki przez membrany poliwęglanowe o rozmiarze porów 0,22 μm. Przemyj filtry 10 ml PBS. Przejdź niezwłocznie do następnego kroku lub przechowuj filtry w temperaturze -20°C.

3. Immunodetekcja in situ wbudowania BrdU

1. Odmrozić filtry (próbki z dodatkiem DOC, kontrole bez dodatku oraz kontrole negatywne) w temperaturze pokojowej.
2. Nanieść 1 ml roztworu lizozymu [10 mg/ml lizozymu z białka jaja w 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] ⁴, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przepłukać filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.
3. Dodać 1 ml roztworu proteinazy K [2 mg/ml proteinazy K w 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] ⁴, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przepłukać filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.
4. Dodać 1 ml roztworu egzonukleazy [egzonukleaza III (50 U/ml) w 5 mM MgCl₂ i 50 mM Tris-HCl] ⁵, aby pokryć komórki bakteryjne na filtrze. Inkubować w 37 °C przez 30 minut. Przepłukać filtr, przepuszczając przez niego 10 ml PBS pod próżnią.
5. Złożyć komory inkubacyjne typu frame-seal (Bio-Rad) zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Pokroić filtr na ósemki za pomocą sterylnego ostrza na suchej powierzchni oczyszczonej alkoholem.
7. Za pomocą pęsety umieścić jedną ósmą część filtra w jednej złożonej komorze inkubacyjnej frame-seal (dla każdej próbki filtra wymaganych jest osiem komór frame-seal). Strona fragmentu filtra zawierająca komórki powinna być skierowana do góry. Wilgoć na tylnej stronie filtra pozwoli mu przywrzeć do szkiełka. Jeśli filtr wyschnie, przed umieszczeniem go na szkiełku nanieść małą kroplę (2 μl) diH₂O na środek komory.

Kroki 3.8-3.20 wykorzystują odczynniki z zestawu ROCHE In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS, zgodnie z procedurami zmodyfikowanymi względem instrukcji producenta. Z wyjątkiem PBS, wszystkie odczynniki są dostarczone w zestawie.

8. Nanieś odpowiednią ilość buforu inkubacyjnego (0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Tween20 w PBS), aby równomiernie pokryć cały fragment filtra w komorze inkubacyjnej, tak aby po założeniu uszczelnienia nie doszło do przelania.
9. Nałóż poliestrową pokrywę na ramkę komory inkubacyjnej. Dociśnij, aby szczelnie zamknąć komorę. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza nad filtrem. Inkubuj zamknięte komory przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
10. Zdejmij poliestrową uszczelkę i otwórz komory inkubacyjne. (Uwaga: otwieranie komór czasem powoduje odklejenie się uszczelki ramki od preparasu. W takim przypadku należy przygotować nową komorę do kolejnych etapów).
11. Odpipetuj bufor inkubacyjny z jednego narożnika komory. Unikaj kontaktu z filtrem.
12. Przepłucz filtr, delikatnie pipetując 100 μl PBS do komory i z niej 3 razy.
13. Przygotuj roztwór roboczy anti-BrdU-FLUOS zgodnie z zaleceniami producenta bezpośrednio przed użyciem.
14. Nanieś pipetą 120 μl roztworu roboczego anti-BrdU-FLUOS na filtr, dbając o równomierne pokrycie całej powierzchni.
15. Ponownie zamknij komorę nową poliestrową pokrywą. Unikaj pęcherzyków powietrza na powierzchni filtra. Inkubuj komorę w ciemności w 37 °C przez 3 godziny. Ten etap pozwoli na znakowanie in situ DNA z wbudowanym BrdU izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC).
16. Zdejmij poliestrową pokrywę i otwórz komorę inkubacyjną. Odpipetuj roztwór roboczy anti-BrdU-FLUOS. Przepłucz filtr 3 razy PBS.
17. Przenieś filtr z komory inkubacyjnej na sterylną powierzchnię. Pokrój fragment filtra na małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza.
18. Przenieś kawałki filtra do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, z których każda zawiera 1 ml PBS. Szczelnie zamknij probówkę i zabezpiecz parafilmem. Inkubuj w 37 °C przy 200 rpm przez 10 min.
19. Umieść probówki w vortexerze i mieszaj z maksymalną prędkością przez 5 minut. Przenieś supernatant pipetą do sterylnej probówki Eppendorf 15 ml. Powtórz etapy inkubacji i vortexowania jeszcze 5 razy. Połącz supernatnaty w tej samej probówce Eppendorf 15 ml dla każdej próbki. Zazwyczaj w zawiesinie można odzyskać 80% komórek.
20. Przechowuj supernatant z resuspenderowanymi komórkami w 4 °C. Przeprowadź sortowanie w ciągu 2 dni.

4. Analiza FACS

W niniejszym materiale opisano procedurę dla cytometru przepływowego BD FACSAria oraz odpowiadającego mu oprogramowania.

1. Zoptymalizować ustawienia cytometru przepływowego zgodnie z krokami zalecanymi przez producenta. Obejmuje to: dostrojenie kontroli wzmocnienia w celu ustawienia wymaganych parametrów odcięcia oraz punktu optymalnego (sweet spot); optymalizację opóźnienia lasera i czynników skalowania obszaru dla ciśnienia osłonki stosowanego w eksperymencie oraz optymalizację ustawień napięć FSC i SSC, progu FSC, skalowania fluorescencji FSC, napięć PMT dla fluorescencji itp.
2. Przeanalizować próbki kontrolne negatywne za pomocą cytometru przepływowego (FCM), opierając się na intensywności fluorescencji FITC i rozproszeniu bocznym (SSC). Zwiększać próg FITC, aż do momentu, gdy żadne komórki w kontrolach negatywnych nie będą widoczne na wyświetlaczu akwizycji FITC-SSC.
3. Przeanalizować próbki kontrolne bez dodatków i zbadać wzorzec rozkładu 10 000 komórek na podstawie akwizycji FITC i SSC. Zdefiniować bramkę (gate) obejmującą wszystkie komórki i oznaczyć je jako „komórki o niskiej intensywności” (LIs).
4. Przeanalizować próbki z dodatkiem DOC i zbadać wzorzec rozkładu 10 000 komórek na podstawie FITC i SSC. Część komórek pojawi się w wcześniej zdefiniowanej bramce LI. Zdefiniować kolejną bramkę dla komórek o wyższej intensywności fluorescencji (HIs) niż LIs. Przeanalizować statystyki, aby ocenić względną liczebność komórek w wybranych bramkach.
5. Posortować komórki HI do probówek zbiorczych zawierających 500 μl PBS w trybie „purify 1 drop”. Przerwać sortowanie, gdy liczba HI osiągnie 500 000 zdarzeń.

5. Filtracyjna amplifikacja PCR genów 16S rRNA

Procedury Filter PCR zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Kirchman i wsp. ⁶

1. Przefiltruj posortowane komórki na biały filtr membranowy z poliwęglanu o rozmiarze porów 0,22 μm i średnicy 25 mm. Odetnij sterylnym ostrzem krawędź filtra, która nie zawiera komórek bakteryjnych. Potnij filtr na 8 równych części.
2. Umieść pojedynczy fragment filtra w probówce do reakcji PCR, stroną z komórkami skierowaną do wnętrza probówki. Dodaj 45 μl wody klasy PCR do probówki. Całkowicie zanurz filtr w wodzie.
3. Dodaj 2 kulek ROCHE illustra PuReTaq Read-To-Go PCR Beads do probówki, krótko wymieszaj w wirówce typu vortex. Do każdej probówki dodaj po 2 μl starterów forward i reverse dla genu 16S rRNA (końcowe stężenie każdego startera wynosi 0,4 μM), takich jak 27F i 1492R ⁷.
4. (Opcjonalnie) Dodaj 1 μl roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA, stężenie końcowe 30 μg/100 μl) do mieszaniny reakcyjnej PCR, aby pomóc w adsorpcji inhibitorów amplifikacji. W przypadku rezygnacji z dodania BSA, dodaj zamiast tego 1 μl wody.
5. Przeprowadź amplifikację PCR w termocyklerze. Zaleca się program touch down PCR, w którym temperatura przyłączania maleje sekwencyjnie od 62 do 52°C o 1°C na cykl przez 11 cykli, a następnie następuje 15 cykli z temperaturą przyłączania 52°C. Wszystkie cykle obejmują etapy denaturacji (w 95°C), przyłączania (od 62 do 52°C) i elongacji (w 72°C) o czasie trwania 50 s. Program PCR obejmuje również wstępną denaturację przez 3 min oraz końcową elongację przez 10 min.
6. Potwierdź amplifikację PCR za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym 1% barwionym bromkiem etydyny. Wyciąć amplikony PCR z żelu i oczyścić je za pomocą zestawu QIAGEN QIAquick gel extraction kit.
7. Przeprowadź dwie dodatkowe amplifikacje PCR dla każdej próbki, za każdym razem używając nowego fragmentu filtra. Po oczyszczaniu żelowym PCR połącz amplikony z tej samej próbki. Oczyszczone amplikony 16S rDNA są teraz gotowe do szeregu analiz molekularnych pozwalających na identyfikację taksonomiczną, takich jak konstrukcja bibliotek klonalnych i sekwencjonowanie.

6. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywne wyniki opisano na przykładzie badania bakterii degradujących putrescinę. Próbki wody pobrano z obszaru wybrzeża Georgii i poddano obróbce zgodnie z opisanymi powyżej procedurami. Analiza FACS wykazała, że dodatek putresciny indukuje rozwój grupy bakterii o wysokiej intensywności fluorescencji FITC, co wskazuje na wysoką szybkość wbudowywania BrdU (Rycina 1). Komórki te określono jako komórki o wysokim poziomie wbudowania BrdU (HIs), w których spodziewano się obecności głównie bakterii degradujących putrescinę. HIs nie wystąpiły w kontrolach bez dodatku, które zawierały jedynie komórki o niższym poziomie wbudowania BrdU (LIs). Spodziewano się, że LIs będą składać się głównie z bakterioplanktonu niezdolnego do wykorzystania dodanej putresciny. Komórki HIs wyselekcjonowano do osobnych probówek, a następnie zebrano na filtry membranowe. Amplikony genu 16S rRNA dla komórek HI uzyskano za pomocą PCR z filtra.

Rycina 1. Analiza cytometryczna próbek kontrolnych oraz próbek wzbogaconych związkiem modelowym (tutaj na przykładzie putrescyny), pobranych po 24 h inkubacji. Analiza rozkładu komórek opierała się na (1) intensywności fluorescencji znakowania FITC (oś x), która jest dodatnio skorelowana z poziomem wbudowania BrdU, oraz (2) rozproszeniu bocznym (SSC, oś y), które jest dodatnio skorelowane z rozmiarem komórek. Oznaczenia bramek opierają się na poziomie wbudowania BrdU (HI – wysokie wbudowanie BrdU; LI – niskie wbudowanie BrdU). W odpowiednich bramkach przedstawiono względny procent komórek HI i LI.

Dyskusja

Nasze podejście łączy wbudowywanie BrdU, FACS oraz analizę 16S rDNA, co pozwala na identyfikację na poziomie gatunkowym bakterioplanktonu metabolizującego poszczególne komponenty DOC w środowiskach wodnych. Test wbudowywania BrdU znakuje komórki bakteryjne na podstawie aktywności metabolicznej, co umożliwia analizę wyłącznie aktywnych bakterii i tym samym wyklucza komórki w stanie uśpienia. W naszym podejściu wbudowywanie BrdU jest wykrywane immunologicznie in situ, a bakterie o różnych poziomach wbudowania BrdU...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BrdU	Odczynnik	Sigma-Aldrich	B5002-5G
Lizozym	Odczynnik	Sigma-Aldrich	L6876-5G
Proteinaza K	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P2308-25MG
Zestaw do badania proliferacji komórek in situ, FLUOS	Zestaw	Roche Group	11810740001	Zużyć więcej przeciwciała Anti-BrdU-FLUOS oraz buforu inkubacyjnego na jedną reakcję, niż sugeruje producent.
Komory inkubacyjne Frame-Seal	Materiał	Bio-Rad	SLF-1201
Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 142 mm, rozmiar porów 1,0 μm)	Materiał	EMD Millipore	FALP14250
Filtry membranowe z poliwęglanu (średnica 25 mm, rozmiar porów 0,2 μm)	Materiał	EMD Millipore	FGLP02500
Kuleczki do PCR illustra PuReTaq Ready-To-Go	Zestaw	GE Healthcare	27-9559-01
Zestaw do oczyszczania DNA z żelu QIAquick	Zestaw	Qiagen	28704
System PCR FailSafe	Zestaw	Epicentre Biotechnologies	FS99060