Artykuł metodologiczny

Znakowanie ReAsH/FlAsH i analiza obrazu białek czujnika tetracysteiny w komórkach

DOI:

10.3791/2857

⸱

31 sierpnia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwniki biarsenowe FlAsH i ReAsH wiążą się specyficznie z motywami tetracysteiny w białkach i mogą selektywnie oznaczać białka w żywych komórkach. Ostatnio ta strategia znakowania została wykorzystana do opracowania czujników dla różnych konformacji białek lub stanów oligomerycznych. Opisujemy podejście do etykietowania i metody ilościowej analizy wiązania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka fluorescencyjne i barwniki są niezbędnymi narzędziami do badania transportu, lokalizacji i funkcji białek w komórkach. Podczas fluorescencji białka, takie jak białko zielonej fluorescencji (GFP), są szeroko stosowane jako partnerzy fuzyjny białek do śledzenia właściwości białkabędącego przedmiotem zainteresowania 1, niedawne Odkrycia z mniejszymi znacznikami umożliwiają badanie nowych funkcji białek w komórkach, takich jak zmiany konformacyjne i asocjacja białek 2, 3. Jeden mały System znaczników obejmuje motyw tetracysteiny (CCXXCC) genetycznie wstawiony do białka docelowego, który wiąże się z barwnikami biarsenowymi, ReAsH (czerwona fluorescencja) i FlAsH (zielona fluorescencyjna), o wysokiej swoistości nawet w żywych komórkach 2. System barwników TC/biarsenowych oferuje znacznie mniejsze ograniczenia steryczne dla białka gospodarza niż Białka fluorescencyjne, które umożliwiły kilka nowych podejść do pomiaru zmian konformacyjnych i interakcji białko-białko 4-7. Niedawno opracowaliśmy nowatorskie zastosowanie znaczników TC jako czujników oligomeryzacji w komórkach wyrażających zmutowaną huntingtynę, która po mutacji agreguje się w neuronach w chorobie Huntingtona Choroba 7. Huntingtyna została oznaczona dwoma barwnikami fluorescencyjnymi, jednym białkiem fluorescencyjnym do śledzenia lokalizacji białka, a drugim znacznikiem TC, który tylko Wiąże barwniki biarsenowe w monomerach. W związku z tym zmiany w kolokalizacji między białkiem a reaktywnością barwnika biarsenowego umożliwiły submikroskopowy oligomer zawartość, która ma być mapowana przestrzennie w komórkach. W tym miejscu opisujemy, jak znakować białka znakowane TC połączone z białkiem fluorescencyjnym (Cherry, GFP lub CFP) z FlAsH lub ReAsH w żywych komórkach ssaków i jak określić ilościowo dwie kombinacje fluorescencji kolorów (kombinacje Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH lub GFP/ReAsH).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek do znakowania za pomocą ReAsH/FlAsH

  1. Korzystając ze standardowych metod hodowli komórkowych dla interesującej Cię linii komórkowej, przygotuj hodowlę przylegających komórek bezpośrednio na szkiełku do obrazowania żywych komórek, gotowym do transfekcji.
  2. Przetransfekuj swój plazmid zawierający gen oznaczony TC, który Cię interesuje, zgodnie z wybraną metodą transfekcji.

Zauważ, że ważne jest, aby używać kontroli pozytywnych i ujemnych do oceny zakresu specyficznego wiązania ze znacznikami TC oraz do oceny krwawienia fluorescencji między kanałami podczas zbierania mikrofotografii konfokalnych. W związku z tym w przypadku dwóch kolorów (np. FlAsH/Cherry lub ReAsH/CFP lub ReAsH/GFP) należy upewnić się, że próbki są przygotowane dla pojedynczych kolorów (np. Samo białko fluorescencyjne lub, jeśli to możliwe, białko znakowane TC związane z FlAsH/ReAsH, ale bez białka fluorescencyjnego)

  1. Jeden do dwóch dni po transfekcji delikatnie przepłukać komórki 300 μl wstępnie podgrzanego (w temperaturze 37 °C) HBSS.
  2. Delikatnie zanurzyć komórki z 1 μM FlAsH (lub ReAsH) w 300 μl wstępnie podgrzanego HBSS i 10 μM 1,2-etanedhiolu (EDT).

Ważne jest, aby najpierw dodać EDT przed dodaniem FlAsH/ReAsH i utworzyć bufor tuż przed dodaniem go do komórek. Inkubować dokładnie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Z naszego doświadczenia wynika, że dłuższy czas inkubacji znacznie zwiększa fluorescencję tła. Nowe konstrukcje powinny być również zoptymalizowane pod kątem czasu etykietowania i stężenia FlAsH/ReAsH (0,5-2 μM).

  1. Delikatnie odessać roztwór do znakowania z komórek, a następnie zastąpić 300 μl wstępnie podgrzanego HBSS + 250 μM 2,3-dimerkaptopropanolu (BAL) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Usunąć roztwór myjący przez delikatne zasysanie i zastąpić go 300 μl podgrzanego HBSS.

Po tym myciu, komórki mogą być utrwalone za pomocą paraformaldehydu (15 minut z 3,2% roztworem), chociaż stwierdziliśmy, że zwiększa to niespecyficzną fluorescencję barwnika biarsenowego. W związku z tym zwykle obrazujemy komórki na żywo w temperaturze pokojowej. (Należy pamiętać, że utrwalenie komórek przed znakowaniem zapobiega wiązaniu barwnika biarsenowego).

2. Obrazowanie komórek pod mikroskopem konfokalnym

  1. W mikroskopie konfokalnym ustaw parametry obrazowania poszczególnych fluoroforów (patrz Tabela 1) i upewnij się, że krwawienie między kanałami jest znikome. Można to osiągnąć, sprawdzając poszczególne fluorofory (w próbkach kontrolnych) w odniesieniu do każdego innego ustawienia akwizycji fluorescencji dla fluorescencji. Regulacja zakresu długości fali emisji może pomóc w zminimalizowaniu krwawienia (chociaż może to również zmniejszyć sygnał/szum).
  2. Dostosuj również ustawienia fotopowielacza tak, aby maksymalna fluorescencja w próbce nie nasycała detektora. (Można to wykryć za pomocą ustawienia Q-LUT w SP2 Leica confocal). Po ustaleniu najlepszych ustawień obrazowania nie należy zmieniać żadnego z nich między próbkami.
  3. Inne ustawienia, których zwykle używamy (chociaż można je zoptymalizować) to częstotliwość skanowania 200 Hz i zbieranie 4 średnich linii oraz średnicy otworu 1 jednostki Airy. Średnica otworka może zostać zwiększona, jeśli problemem jest sygnał/szum, jednak może to spowodować pewną utratę obrazu.
  4. Jeśli to możliwe, zbierz obrazy konfokalne w formacie 12-bitowym (lub wyższym). Format 12-bitowy przechwytuje większy zakres dynamiczny wartości (0-4095) dla każdej intensywności piksela niż format 8-bitowy (0-255). Jest to ważne dla zapewnienia, że rejestrowany jest najbogatszy zestaw danych, co maksymalizuje jakość analizy danych ilościowych.
  5. Zbierz obrazy kanału białka fluorescencyjnego (Cherry, GFP lub CFP), a także kanału barwnika biarsenowego (FlAsH lub ReAsH) dla wszystkich próbek.

3. Analiza danych

  1. Zainstaluj oprogramowanie ImageJ na swoim komputerze8. http://rsbweb.nih.gov/ij/
  2. Upewnij się, że Twoja wersja ImageJ ma następujące wtyczki:
  3. Otwórz ImageJ, a jeśli używasz wersji starszej niż v1.32c, kliknij następujące opcje, aby umożliwić otwieranie wielu obrazów jednocześnie (co można zrobić, przytrzymując przycisk sterowania podczas klikania różnych plików):
    figure-protocol-1
  4. Otwórz interesujące Cię obrazy w ImageJ.
    ImageJ automatycznie zdefiniuje maksymalną i minimalną intensywność pikseli, które są wyświetlane na ekranie dla każdego obrazu z osobna. Biorąc pod uwagę, że różne obrazy będą miały różną intensywność pikseli, oznacza to, że wyświetlane obrazy NIE SĄ porównywalne z oglądanymi.
  5. Aby upewnić się, że wszystkie otwierane obrazy są w tej samej skali, możesz fizycznie zdefiniować intensywność górnych i dolnych pikseli, które mają być wyświetlane (nie zmieni to rzeczywistej zawartości danych obrazów, jak miałoby to miejsce w przypadku niektórych innych programów). Wartości te można ustawić w następującym menu:
    figure-protocol-2
  6. Alternatywnym podejściem jest praca ze stosami, która łączy wszystkie obrazy w jeden plik i automatycznie skaluje (w celu wyświetlenia) wszystkie obrazy w stosie do tej samej skali. Najprostszym sposobem pracy z danymi jest przekonwertowanie każdego kanału na stos. Tak więc dla kanału białka fluorescencyjnego przekształć wszystko w stos, jak pokazano. Możesz łatwo wybrać jeden kanał, układając w stos wszystkie obrazy zawierające nazwę pospolitą (np. "ch00") w tytule.
    figure-protocol-3
  7. Teraz przekonwertuj wszystkie otwarte obrazy na 8-bitowe w celu analizy. Spowoduje to przeskalowanie wyświetlanego zakresu do zakresu 0-255 (który definiuje 8-bitowy).
    WAŻNE: Nie zapisuj oryginalnego formatu 12-bitowego (lub wyższego), ponieważ spowoduje to utratę zawartości informacji. Zauważ, że niektóre pakiety oprogramowania mogą wyświetlać tylko obrazy 8-bitowe, więc ten format jest przydatny do tworzenia figur itp.
    figure-protocol-4
  8. Zapisz kopię w nowym folderze o nazwie "8-bit converted" za pomocą opcji "Zapisz jako...".
  9. Jedną z metod badania zakresu wiązania barwnika biarsenowego w całym obrazie jest wykonanie wykresu korelacji intensywności pikseli. Spowoduje to wykreślenie wartości każdego piksela w jednym kanale względem odpowiadającej mu wartości piksela w drugim kanale. W związku z tym pozycja piksela wysoka we fluorescencji CFP będzie również wysoka we fluorescencji ReAsH, jeśli występuje wysokie wiązanie.
  10. Aby przeanalizować korelację pikseli, upewnij się, że 8-bitowe obrazy ReAsH i Cerulean/GFP są otwarte w ImageJ.
  11. Otwórz wtyczkę "Image Correlator", jak wskazano poniżej. Wybierz "Image1" jako stos ReAsH lub FlAsH i "Image2" jako stos białek fluorescencyjnych.
    figure-protocol-5
  12. Wynikowy stos może nie wyświetlać żadnych szczegółowych informacji - jest to normalne. Zapisz stos w nowym folderze o nazwie "Wykresy rozrzutu" i nadaj mu taką samą nazwę pliku, jak próbce, do której się odnosi (np. "FlAsH-cherry correlation plot")
  13. Aby wyświetlić dane w sposób znaczący, możesz skorzystać z jednej z dwóch opcji. Najpierw przekształć dane tak, aby były w formacie dziennika. Następnie wizualnie przeskaluj dane w następujący sposób:
    figure-protocol-6
  14. Alternatywnie możesz przeskalować dane wizualnie, aby pokazać tylko niskie wartości (np. 1-255) i wyświetlić dane za pomocą specjalnej tabeli LUT. Tablica LUT (Look Up Table) reprezentuje tabelę kolorów, które są przypisane do każdej wartości piksela na obrazie. Może to służyć do definiowania pseudoschematu kolorów dla obrazu i jest przydatne do definiowania pewnych cech obrazu. Aby utworzyć niestandardową tablicę LUT, kliknij "Edytor LUT" i utwórz nową, taką jak pokazana (można ją zapisać i użyć później).
    figure-protocol-7
  15. Ustaw zakres jasności/kontrastu od 0 do 255 (zgodnie z opisem w kroku 13 powyżej). Aby "zablokować" obraz tak, jak pokazano na ekranie, obraz można przekonwertować do formatu RGB, który zapisuje 8-bitową wartość dla każdego z czerwonych, zielonych i niebieskich kolorów każdego piksela.
    figure-protocol-8
    Aby skopiować i wkleić obrazy do innych programów, najpierw otwórz obrazy 8-bitowe lub 16-bitowe. Zgodnie z opisem w kroku 14 powyżej przypisz do obrazu schemat kolorów LUT. W przypadku CFP przypisz "błękitną" tablicę LUT zgodnie z poniższym opisem...
    figure-protocol-9
  16. Wybierz obraz i aby skopiować go do schowka, wybierz...
    figure-protocol-10

4. Reprezentatywne wyniki:

Sukces znakowania komórek barwnikami biarsenowymi zależy od kilku kluczowych parametrów. Po pierwsze, czas etykietowania z barwniki mają kluczowe znaczenie. Odkryliśmy, że dłuższe okresy etykietowania (ponad 30 minut) skutkują wysokim poziomem niespecyficznego barwienia tła. Ryc. 1 pokazuje typowy wynik dla dzikiej formy fragmentu huntingtyny (25Q) połączonego z pochodną CFP Cerulean, zawierającą znacznik TC, jak opisano poprzednio7. Ta próbka była barwiona przez 30 minut za pomocą ReAsH, a w próbce jest minimalne tło pozbawione znacznika TC. Odkryliśmy, że utrwalanie komórek za pomocą paraformaldehydu zwiększa tło, podczas gdy utrwalanie metanolem znosi fluorescencję znacznika białka fluorescencyjnego. Dlatego tam, gdzie to możliwe, obrazujemy komórki na żywo. Należy również zauważyć, że utrwalenie przed znakowaniem barwnikami biarsenowymi zapobiega ich wiązaniu, prawdopodobnie z powodu modyfikacji motywu TC.

Kolejnym czynnikiem decydującym o spójnych wynikach jest gęstość komórek. Odkryliśmy, że bardzo ważne jest obrazowanie komórek, które są luźno rozmieszczone, a także że rozległe zlepianie się może prowadzić do nierównomiernego barwienia barwników biarsenowych w różnych komórkach.

figure-protocol-11
Rysunek 1. Znaczniki tetracysteiny i barwienie ReAsH w żywych komórkach transfekowanych fuzjami huntingtyny (exon1-25Q) i Cerulean. Znacznik TC znajduje się na styku fuzji huntingtyny i Cerulean (jak opisano w punkcie 7). Wykres korelacji intensywności pikseli umożliwia ocenę różnic w wiązaniu ReAsH w całej komórce i może być wykorzystany do mapowania zmian w wiązaniu ReAsH spowodowanych zmianami konformacyjnymi lub interakcjami ligandów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście polegające na znakowaniu lokalizacji białka za pomocą białka fluorescencyjnego i właściwości konformacyjnych za pomocą drugiego barwnika oferuje wiele Potencjał do mapowania, gdzie w komórkach gromadzą się różne konformacje białek i zdarzenia, które zmieniają dynamikę konformacji białek. ReAsH/FlAsH został po raz pierwszy użyty jako czujnik wewnątrzkomórkowy do fałdowania białek białka I 4 wiążącego kwas retinowy u ssaków. W tym przykładzie FlAsH związany ze znacznikiem TC zmodyfikowanym w komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów dla DMH i TDM (granty projektów NHMRC). DMH jest stypendystą Grimwade, finansowanym przez Miegunyah Trust.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka 8-dołkoweIbidi80826Uważamy, że te szkiełka komorowe są szczególnie przydatne do hodowli komórek do obrazowania.
TC-FlAsH II Zestaw do wykrywania znaczników tetracysteiny w komórce *zielona fluorescencja* *do obrazowania żywych komórekInvitrogenT34561 (FlAsH) lub T34562 (ReAsH)
Hanks' Zrównoważony roztwór soli Invitrogen14175-103
2,3-dimerkapto-1-propanolSigma-AldrichD1129-5ML
1,2-EthanedithiolSigma-Aldrich02390-25ML

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
  3. Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
  4. Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
  5. Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
  6. Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
  7. Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
  8. Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  9. Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
  10. Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
  11. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczanie znacznikiem tetracysteinyznakowanie barwnikiem biarsenowymobrazowanie FlAsH ReAsHanaliza mikroskopi konfokalnkwantyfikacja w programie Image Jdetekcja oligomeryzacji bia ekobrazowanie ywych kom rekfuzja bia ek fluorescencyjnychspecyficzno znacznika TCmodel choroby Huntingtona

Powiązane artykuły