Barwniki biarseniowe FlAsH i ReAsH wiążą się specyficznie z motywami tetracysteiny w białkach i mogą selektywnie znakować białka w żywych komórkach. Niedawno strategia znakowania ta została wykorzystana do opracowania sensorów różnych konformacji białek lub stanów oligomerycznych. Opisujemy podejście do znakowania oraz metody ilościowej analizy wiązania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie ReAsH/FlAsH oraz analiza obrazu białek sensorowych tetracysteiny w komórkach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka fluorescencyjne i barwniki są niezbędnymi narzędziami do badania transportu, lokalizacji i funkcji białek w komórkach. Podczas gdy białka fluorescencyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), były szeroko stosowane jako partnery do fuzji z białkami w celu śledzenia właściwości białka docelowego1, niedawne osiągnięcia w zakresie mniejszych znaczników umożliwiają badanie nowych funkcjonalności białek w komórkach, takich jak zmiany konformacyjne i asocjacje białkowe 2, 3. Jeden z systemów małych znaczników obejmuje motyw tetracysteinowy (CCXXCC) wprowadzony genetycznie do białka docelowego, który wiąże się z barwnikami biarsenicznymi, ReAsH (fluorescencja czerwona) i FlAsH (fluorescencja zielona), z wysoką swoistością nawet w żywych komórkach 2. System TC/barwnik biarsenicowy stwarza znacznie mniejsze ograniczenia steryczne dla białka gospodarza niż białka fluorescencyjne, co umożliwiło zastosowanie kilku nowych podejść do pomiaru zmian konformacyjnych i oddziaływań białko-białko 4-7. Opracowaliśmy niedawno nową aplikację znaczników TC jako sensorów oligomeryzacji w komórkach wykazujących ekspresję zmutowanej huntingtyny, która po mutacji ulega agregacji w neuronach w chorobie Huntingtona 7. Huntingtyna została oznakowana dwoma barwnikami fluorescencyjnymi: jednym białkiem fluorescencyjnym do śledzenia lokalizacji białka oraz drugim znacznikiem TC, który wiąże barwniki biarsenicze wyłącznie w monomerach. Zatem zmiany w kolokalizacji między białkiem a reaktywnością barwnika biarseniczniego umożliwiły przestrzenne mapowanie submikroskopowej zawartości oligomerów wewnątrz komórek. W niniejszym protokole opisujemy sposób znakowania białek z tagiem TC połączonych z białkiem fluorescencyjnym (Cherry, GFP lub CFP) za pomocą FlAsH lub ReAsH w żywych komórkach ssaków oraz sposób kwantyfikacji fluorescencji dwubarwnej (kombinacje Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH lub GFP/ReAsH).
Protokół
1. Przygotowanie komórek do znakowania za pomocą ReAsH/FlAsH
- Stosując standardowe metody hodowli komórkowej dla wybranej linii komórkowej, przygotuj hodowlę komórek adherentnych bezpośrednio na szkiełku do obrazowania żywych komórek, gotowym do transfekcji.
- Przeprowadź transfekcję plazmidu zawierającego gen zainteresowania z tagiem TC, stosując wybraną metodę transfekcji.
Należy pamiętać, że ważne jest zastosowanie kontroli pozytywnych i negatywnych w celu oceny stopnia specyficznego wiązania z tagami TC oraz oceny przenikania fluorescencji między kanałami podczas pozyskiwania mikrografii konfokalnych. Z tego względu, w przypadku dwóch kolorów (np. kombinacji FlAsH/Cherry, ReAsH/CFP lub ReAsH/GFP), należy upewnić się, że przygotowano próbki dla pojedynczych kolorów (np. samo białko fluorescencyjne lub, jeśli to możliwe, białko z tagiem TC związane z FlAsH/ReAsH, ale bez białka fluorescencyjnego)
- Od jednego do dwóch dni po transfekcji delikatnie wypłucz komórki 300 μL podgrzanego (do 37 °C) HBSS.
- Delikatnie zanurz komórki w 300 μL podgrzanego HBSS zawierającego 1 μM FlAsH (lub ReAsH) oraz 10 μM 1,2-etanoditiolu (EDT).
Ważne jest, aby najpierw dodać EDT przed dodaniem FlAsH/ReAsH oraz przygotować bufor bezpośrednio przed dodaniem go do komórek. Inkubować dokładnie przez 30 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. W naszym doświadczeniu dłuższy czas inkubacji znacząco zwiększa fluorescencję tła. Nowe konstrukty powinny zostać również zoptymalizowane pod kątem czasu znakowania i stężenia FlAsH/ReAsH (0,5-2 μM).
- Ostrożnie odessać roztwór znakujący z komórek, a następnie zastąpić go 300 μL uprzednio ogrzanego HBSS + 250 μM 2,3-dimerkaptopropanolu (BAL) i inkubować przez 15 min w 37 °C.
- Usunąć roztwór płuczący poprzez ostrożne odessać i zastąpić go 300 μL uprzednio ogrzanego HBSS.
Po tym płukaniu komórki można utrwalić paraformaldehydem (15 min w 3,2% roztworze), choć zauważyliśmy, że zwiększa to nieswoistą fluorescencję barwnika biarsenowego. Dlatego zazwyczaj obrazujemy żywe komórki w temperaturze pokojowej. (Należy pamiętać, że utrwalenie komórek przed znakowaniem zapobiega wiązaniu barwnika biarsenowego).
2. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego
- W mikroskopie konfokalnym skonfigurować parametry obrazowania dla poszczególnych fluoroforów (patrz Tabela 1) i upewnić się, że przenikanie sygnału (bleedthrough) między kanałami jest pomijalne. Można to osiągnąć, sprawdzając poszczególne fluorofory (w próbkach kontrolnych) przy każdym z różnych ustawień akwizycji fluorescencji. Regulacja zakresu długości fali emisji może pomóc zminimalizować przenikanie sygnału (choć może to również zmniejszyć stosunek sygnału do szumu).
- Należy również dostosować ustawienia fotopowielacza tak, aby maksymalna fluorescencja w próbce nie nasycała detektora. (Można to wykryć, korzystając z ustawienia Q-LUT w mikroskopie konfokalnym Leica SP2). Po ustaleniu optymalnych parametrów obrazowania nie należy ich zmieniać pomiędzy próbkami.
- Inne zazwyczaj stosowane przez nas ustawienia (które można jednak zoptymalizować) to prędkość skanowania 200 Hz, uśrednianie 4 linii oraz średnica otworu (pinhole) wynosząca 1 jednostka Airy. Średnicę otworu można zwiększyć, jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski, jednak może to skutkować pewną utratą jakości obrazowania.
- Obrazy konfokalne należy zbierać w formacie 12-bitowym (lub wyższym), jeśli to możliwe. Format 12-bitowy rejestruje większy zakres dynamiczny wartości (0-4095) dla intensywności każdego piksela niż format 8-bitowy (0-255). Jest to istotne dla zapewnienia zarejestrowania jak najbogatszego zestawu danych, co maksymalizuje jakość ilościowej analizy danych.
- Należy zebrać obrazy dla kanału białek fluorescencyjnych (Cherry, GFP lub CFP) oraz dla kanału barwnika biarszeniowego (FlAsH lub ReAsH) dla wszystkich próbek.
3. Analiza danych
- Zainstaluj oprogramowanie ImageJ na komputerze8. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- Upewnij się, że Twoja wersja programu ImageJ posiada następujące wtyczki:
- Uruchom program ImageJ, a jeśli używasz wersji starszej niż v1.32c, kliknij następujące opcje, aby umożliwić jednoczesne otwarcie wielu obrazów (można to zrobić, przytrzymując klawisz Ctrl podczas klikania różnych plików):
- Otwórz interesujące Cię obrazy w programie ImageJ.
ImageJ automatycznie zdefiniuje maksymalną i minimalną intensywność pikseli wyświetlaną na ekranie oddzielnie dla każdego obrazu. Ponieważ różne obrazy będą miały różną intensywność pikseli, oznacza to, że wyświetlane obrazy NIE SĄ porównywalne w takim widoku. - Aby upewnić się, że wszystkie otwarte obrazy są w tej samej skali, można ręcznie zdefiniować górną i dolną intensywność pikseli do wyświetlenia (nie zmieni to faktycznej zawartości danych obrazów, co mogłoby mieć miejsce w innym oprogramowaniu). Wartości te można ustawić w poniższym menu:
- Alternatywnym podejściem jest praca ze stosami (stacks), co pozwala połączyć wszystkie obrazy w jednym pliku i automatycznie przeskaluje (do wyświetlania) wszystkie obrazy w stosie do tej samej skali. Najprostszym sposobem pracy z danymi jest konwersja każdego kanału na stos. Zatem dla kanału białka fluorescencyjnego przekonwertuj wszystkie na stos, jak pokazano. Można łatwo wybrać jeden kanał, grupując w stos wszystkie obrazy zawierające wspólną nazwę (np. „ch00”) w tytule.
- Teraz przekonwertuj wszystkie otwarte obrazy na format 8-bitowy do analizy. Spowoduje to przeskalowanie wyświetlanego zakresu do zakresu 0-255 (który definiuje format 8-bitowy).
WAŻNE: Nie zapisuj zmian w oryginalnym formacie 12-bitowym (lub wyższym), w przeciwnym razie utracisz zawartość informacji. Należy pamiętać, że niektóre pakiety oprogramowania mogą wyświetlać tylko obrazy 8-bitowe, więc ten format jest przydatny do tworzenia rycin itp.
- Zapisz kopię w nowym folderze o nazwie „8-bit converted”, korzystając z opcji „Save as…”.
- Jedną z metod badania zakresu wiązania barwnika biarsenowego w całym obrazie jest wykonanie wykresu korelacji intensywności pikseli. Wykres ten przedstawia wartość każdego piksela w jednym kanale w stosunku do odpowiadającej mu wartości piksela w drugim kanale. Zatem pozycja piksela o wysokiej fluorescencji CFP będzie miała również wysoką fluorescencję ReAsH, jeśli wiązanie jest wysokie.
- Aby przeanalizować współkorelację pikseli, upewnij się, że obrazy 8-bitowe ReAsH oraz Cerulean/GFP są otwarte w programie ImageJ.
- Otwórz wtyczkę „Image Correlator”, jak wskazano poniżej. Wybierz „Image1” jako stos ReAsH lub FlAsH oraz „Image2” jako stos białka fluorescencyjnego.
- Powstały stos może nie wyświetlać żadnych szczegółowych informacji – jest to normalne. Zapisz stos w nowym folderze o nazwie „Scatterplots” i nadaj mu taką samą nazwę pliku, jak próbka, której dotyczy (np. „FlAsH-cherry correlation plot”).
- Aby dane były czytelne, możesz wybrać jedną z dwóch opcji. Najpierw przekształć dane na format logarytmiczny. Następnie wizualnie przeskaluj dane w następujący sposób:
- Alternatywnie możesz przeskalować dane wizualnie tak, aby wyświetlać tylko niskie wartości (np. 1-255) i wyświetlać dane za pomocą specjalnej tablicy LUT. LUT (Look Up Table) to tabela kolorów przypisanych do każdej wartości piksela w obrazie. Może ona służyć do zdefiniowania schematu pseudokolorów dla obrazu i jest przydatna do definiowania określonych cech obrazu. Aby utworzyć własną tablicę LUT, kliknij „LUT editor” i stwórz nową, taką jak ta pokazana (można ją zapisać i wykorzystać później).
- Ustaw zakres jasności/kontrastu od 0-255 (jak opisano w kroku 13 powyżej). Aby „utrwalić” obraz tak, jak jest on wyświetlany na ekranie, można go przekonwertować na format RGB, który zapisuje wartość 8-bitową dla każdego z kolorów czerwonego, zielonego i niebieskiego każdego piksela.
Aby kopiować i wklejać obrazy do innych programów, otwórz najpierw obrazy 8- lub 16-bitowe. Jak opisano w kroku 14 powyżej, przypisz obrazowi schemat kolorów LUT. Dla CFP przypisz LUT „Cyan”, jak opisano poniżej…
- Wybierz obraz, a aby skopiować go do schowka, wybierz…
4. Reprezentatywne wyniki:
Sukces znakowania komórek barwnikami biarsenkalnymi zależy od kilku kluczowych parametrów. Po pierwsze, kluczowy jest czas znakowania barwnikami. Stwierdziliśmy, że przedłużony czas znakowania (powyżej 30 min) prowadzi do wysokiego poziomu niespecyficznego barwienia tła. Rys. 1 przedstawia typowy wynik dla fragmentu białka huntingtyny typu dzikiego (25Q) połączonego z pochodną CFP, Cerulean, zawierającą znacznik TC, zgodnie z wcześniejszym opisem 7. Próbka ta była barwiona przez 30 min barwnikiem ReAsH, a w próbce pozbawionej znacznika TC tło jest minimalne. Stwierdziliśmy, że utrwalanie komórek paraformaldehydem zwiększa tło, natomiast utrwalanie metanolem znosi fluorescencję białka fluorescencyjnego. Dlatego, w miarę możliwości, obrazujemy żywe komórki. Należy również zauważyć, że utrwalanie przed znakowaniem barwnikami biarsenkalnymi zapobiega ich wiązaniu, prawdopodobnie z powodu modyfikacji motywu TC.
Kolejnym krytycznym czynnikiem warunkującym powtarzalność wyników jest gęstość komórek. Stwierdziliśmy, że kluczowe jest obrazowanie komórek rozproszonych, gdyż nadmierne skupiska mogą prowadzić do nierównomiernego barwienia barwnikami biarsenowymi w poszczególnych komórkach.
Rysunek 1. Znaczniki tetracysteiny i barwienie ReAsH w żywych komórkach transfekowanych fuzjami huntingtina(exon1-25Q)-Cerulean. Znacznik TC znajduje się na złączu fuzji huntingtina-Cerulean (jak opisano w 7). Wykres korelacji intensywności pikseli umożliwia ocenę różnic w wiązaniu ReAsH w całej komórce i może być wykorzystany do mapowania zmian w wiązaniu ReAsH wynikających ze zmian konformacyjnych lub oddziaływań z ligandami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podejście polegające na znakowaniu lokalizacji białka za pomocą białka fluorescencyjnego oraz jego właściwości konformacyjnych za pomocą drugiego barwnika stwarza duży potencjał w mapowaniu miejsc gromadzenia się różnych konformacji białek w komórkach, a także zdarzeń zmieniających dynamikę konformacji białek. ReAsH/FlAsH został po raz pierwszy zastosowany jako sensor wewnątrzkomórkowy do badania fałdowania białka wiążącego kwas retinowy I (cellular retinoic acid-binding protein I) ssaków 4. W tym przykładzie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantów przyznanych DMH i TDM (granty projektowe NHMRC). DMH jest stypendystą Grimwade Fellow, finansowanym przez Miegunyah Trust.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 8-dołkowa μ-preparaty | Ibidi | 80826 | Uznajemy, że takie szkiełka z komorami są szczególnie użyteczne do hodowli komórek przeznaczonych do obrazowania. |
| Zestaw do detekcji wewnątrzkomórkowej znacznika tetracysteiny TC-FlAsH II *zielona fluorescencja* *do obrazowania żywych komórek* | Invitrogen | T34561 (FlAsH) lub T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Zrównoważony roztwór soli | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimerkapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-etanoditiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Bibliografia
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
