Artykuł metodologiczny

Procedura ligacji i punkcji kątnicy

DOI:

10.3791/2860

⸱

7 maja 2011

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology School of Medicine, Temple University , 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Temple University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi model podwiązania i perforacji kątnicy jako wartościowe narzędzie do badania sepsy u ludzi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sepsę u ludzi charakteryzuje zestaw reakcji systemowych w odpowiedzi na intensywną i masową infekcję, której organizm gospodarza nie zdołał opanować lokalnie. Obecnie sepsa znajduje się wśród dziesięciu głównych przyczyn śmiertelności na oddziałach intensywnej terapii w USA 1. W przebiegu sepsy wyróżnia się dwie uznane fazy hemodynamiczne, które mogą na siebie nachodzić. Faza początkowa (hiperdynamiczna) definiowana jest jako masowa produkcja cytokin prozapalnych i reaktywnych form tlenu przez makrofagi i neutrofile, co wpływa na przepuszczalność naczyniową (prowadząc do hipotensji), funkcję serca oraz indukuje zmiany metaboliczne kulminujące w nekrozie tkanek i niewydolności narządowej. W konsekwencji najczęstszą przyczyną zgonów jest ostra niewydolność nerek. Druga faza (hypodynamiczna) to proces przeciwzapalny obejmujący zaburzenia prezentacji antygenów przez monocyty, zmniejszoną proliferację i funkcję limfocytów oraz zwiększoną apoptozę. Stan ten, znany jako immunosupresja lub depresja immunologiczna, gwałtownie zwiększa ryzyko zakażeń wewnątrzszpitalnych i ostatecznie prowadzi do śmierci. Mechanizmy tych procesów patofizjologicznych nie są dobrze scharakteryzowane. Ponieważ obie fazy sepsy mogą powodować nieodwracalne i nieodwracalne uszkodzenia, kluczowe jest określenie stanu immunologicznego i fizjologicznego pacjenta. Jest to główny powód, dla którego wiele leków terapeutycznych okazało się nieskutecznych. Ten sam lek podany na różnych etapach sepsy może działać terapeutycznie, być szkodliwy lub nie wywołać żadnego efektu 2,3. Aby zrozumieć sepsę na różnych poziomach, niezbędny jest odpowiedni i kompleksowy model zwierzęcy, który odtwarza kliniczny przebieg choroby. Ważne jest scharakteryzowanie mechanizmów patofizjologicznych występujących podczas sepsy oraz kontrolowanie warunków modelu w celu testowania potencjalnych czynników terapeutycznych.

W celu zbadania etiologii sepsy u ludzi badacze opracowali różne modele zwierzęce. Najpowszechniej stosowanym modelem klinicznym jest podwiązywanie i nakłuwanie kątnicy (CLP). Model CLP polega na perforacji kątnicy, co umożliwia przedostanie się treści kałowej do jamy otrzewnej, wywołując nasiloną odpowiedź immunologiczną indukowaną infekcją polimikrobiologiczną. Model ten spełnia klinicznie istotne warunki występujące u ludzi. Podobnie jak u ludzi, myszy poddane procedurze CLP z płynoterapią wykazują pierwszą (wczesną) fazę hiperdynamiczną, która z czasem przechodzi w drugą (późną) fazę hipodynamiczną. Ponadto profil cytokinowy jest podobny do tego obserwowanego w sepsie u ludzi, gdzie występuje zwiększona apoptoza limfocytów (przegląd w 4,5). Ze względu na liczne i nakładające się mechanizmy zaangażowane w sepsę, badacze potrzebują odpowiedniego modelu sepsy o kontrolowanym stopniu ciężkości, aby uzyskać spójne i powtarzalne wyniki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Podwiązywanie i nakłuwanie kątnicy jako mysi model sepsy u ludzi

Do tej procedury wykorzystuje się myszy C57BL/6 (w wieku 7-9 tygodni).

  1. Zanurz mysz w narkozie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo roztworu ketaminy (75mg/kg) i ksylazyny (15mg/kg) w stosunku 1:1. Jako punkt odniesienia, wstrzyknij 30 μl roztworu 1:1 myszy o masie 20 gramów. Alternatywnie myszy można znieczulić wziewnie izofluranem przy użyciu parownika anestetycznego.
  2. Wygoń brzuch myszy i zdezynfekuj obszar, najpierw aplikując roztwór betadyny, a następnie przecierając sterylnym gazikiem nasączonym 70% alkoholem (numer 1 na poniższej sekwencji zdjęć). Jako alternatywny środek antyseptyczny można zastosować chlorheksydynę. Opcjonalnie można użyć sterylnej strefy ochronnej, aby utrzymać obszar w czystości.
  3. W warunkach aseptycznych wykonaj laparotomię pośrodkową o długości od 1 do 2 cm i odsłoń kątnicę wraz z przyległym jelitem (2 i 3).
  4. Kątnicę należy ściśle podwiązać nicią jedwabną 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon) u podstawy, poniżej zastawki kątniczo-kątniczej, a następnie przebić raz lub dwa razy igłą 19G (4 i 5) po tej samej stronie kątnicy. Należy pamiętać, że długość podwiązanej kątnicy, zdefiniowana jako odległość od dystalnego końca kątnicy do punktu podwiązania, determinuje stopień ciężkości sepsy. Odległość >1cm powoduje sepsę wysokiego stopnia, natomiast odległość ≤1 cm powoduje sepsę średniego lub niskiego stopnia. Należy również zauważyć, że metoda perforacji kątnicy przedstawiona tutaj różni się od standardowej techniki nakłucia przelotowego (wprowadzenia igły przez całą szerokość kątnicy). Obie metody niezawodnie prowadzą do takiego samego efektu sepsy. Jednak wadą techniki przelotowej jest to, że nie ułatwia ona kontrolowania ilości wydalonego kału podczas ściskania kątnicy.
  5. Następnie kątnicę należy delikatnie ścisnąć, aby wydalić niewielką ilość kału przez miejsca perforacji (6). Kątnica zostaje zawrócona do jamy otrzewnowej, a otrzewna zostaje zamknięta szwami z nici jedwabnej 6.0 (7).
  6. Skórę zamyka się za pomocą klipsów Reflex 7mm (RS-9258, Roboz Surgical Instruments) lub klipsów do ran Michela (7 mm, RS-9270) (8).
  7. Resuscytuj myszy, wstrzykując podskórnie 1 ml uprzednio ogrzanego 0,9% roztworu soli fizjologicznej za pomocą igły 25G. Ta procedura resuscytacji płynowej wywoła hiperdynamiczną fazę sepsy. Ten krytyczny etap jest opisany szerzej w sekcji dyskusji.
  8. Opcjonalnie: Wstrzyknij podskórnie buprenorfinę (0,05mg/kg masy ciała) lub tramadol (20mg/kg masy ciała) w celu zapewnienia pooperacyjnej analgezji. Należy mieć na uwadze, że opioidy te mogą tłumić oddychanie i lokomocję, a efekty te mogą zostać błędnie zinterpretowane jako objawy sepsy.
  9. Zwierzęta umieszcza się tymczasowo na podgrzewalnej macie lub alternatywnie natychmiast przenosi do klatki z ekspozycją na podczerwoną lampę grzewczą o mocy 150W, aż do czasu wybudzenia z narkozy. Czas wybudzania wynosi od 30 min do 1 godziny.
  10. Zapewnij swobodny dostęp do pokarmu i wody (hydrożelu) umieszczonych na dnie klatki.
  11. Myszami monitoruje się przeżywalność co 12 godzin przez okres od jednego do dwóch tygodni lub przeprowadza eutanazję w różnych punktach czasowych w celu analizy poszczególnych parametrów.

Jako kontrolę dla projektu doświadczalnego, zwierzęta w grupie pozorowanej zostaną poddane technice laparotomii bez podwiązania i nakłucia.
Od sześciu do 12 godzin po zabiegu chirurgicznym u myszy wystąpi letarg oraz gorączka, piloerekcja, biegunka, kulenie się i ogólne złe samopoczucie; są to wszystkie objawy sepsy. Myszy z bardzo ciężką sepsą przed śmiercią ledwo się poruszają i wykazują gwałtowny spadek temperatury ciała. Na tym etapie myszy należy poddać eutanazji, aby uniknąć przedłużającego się bólu i cierpienia.

figure-protocol-1

2. Najczęściej analizowane parametry

Aby ocenić wynik procedury, można przeanalizować różne parametry w organach, ekstraktach komórkowych lub płynach ustrojowych. Próbki można pobierać w różnych odstępach czasu, od 3 godzin do jednego tygodnia po zabiegu chirurgicznym.

  1. Przeżywalność myszy.
  2. Cytokiny i chemokiny w surowicy, jamie otrzewnej oraz w ekstraktach z narządów.
    1. Interleukina-6: Produkowana i uwalniana przez monocyty, komórki dendrytyczne, makrofagi, limfocyty B, limfocyty T, granulocyty, komórki tuczne i wiele innych typów komórek. Odgrywa ważną rolę w reakcji ostrej fazy i zapaleniu.
    2. Czynnik martwicy nowotworów-α: Plejotropowa cytokina, która odgrywa centralną rolę w zapaleniu i apoptozie. Produkowana przez monocyty, makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne i fibroblasty.
    3. Interleukina-1β: Produkowana przez monocyty, komórki NK, komórki dendrytyczne, limfocyty B i limfocyty T. Indukuje gorączkę i syntezę białek ostrej fazy.
    4. Interleukina 10: Wspomaga wychwyt fagocytarny i odpowiedzi Th2, ale hamuje prezentację antygenów i prozapalne odpowiedzi Th1.
    5. Interleukina 10: Wspomaga wychwyt fagocytarny i odpowiedzi Th2, ale hamuje prezentację antygenów i prozapalne odpowiedzi Th1.
    6. Monocytyczna białka chemotaktyczne-1 (znane również jako CCL2): Rekrutuje monocyty, limfocyty T pamięci i komórki dendrytyczne do miejsc uszkodzenia tkanek i infekcji.
    7. KC (CXCL1): Produkowana przez makrofagi i komórki śródbłonka. Mysia KC jest silnym atraktantem i aktywatorem neutrofili.
    8. RANTES: Chemoatraktant dla monocytów. Może przyciągać niepobudzone limfocyty T pamięci CD4+/CD45RO+ oraz pobudzone limfocyty T CD4+ i CD8+ o fenotypach naiwnych i pamięci.
    9. Interferon-γ: Wydzielany przez komórki Th1, cytotoksyczne limfocyty T, komórki dendrytyczne i komórki naturalnych zabójców (NK). Zwiększa prezentację antygenów i aktywność lityczną makrofagów oraz hamuje aktywność komórek Th2. Wspomaga adhezję i wiązanie niezbędne do migracji leukocytów oraz promuje aktywność komórek NK.
    10. Białko grupy wysokiej mobilności B-1: W monocytach jest aktywatorem czynnika jądrowego kappa B poprzez wiązanie się z komórkowym receptorem dla końcowych produktów zaawansowanej glikacji (RAGE), co aktywuje uwalnianie mediatorów prozapalnych w późnej fazie sepsy.
  3. Oznaczenie mieloperoksydazy w narządach jako miara infiltracji neutrofili. Mieloperoksydaza (MPO) to enzym peroksydazowy występujący najliczniej w granulocytach neutrofilnych. Jest to białko lizosomalne przechowywane w ziarnistościach azurofilnych neutrofila. MPO posiada pigment hemowy, który nadaje zielony kolor wydzielinom bogatym w neutrofile, takim jak ropa i niektóre formy śluzu.
  4. Obciążenie bakteryjne w narządach i krwiobiegu, mierzone jako liczba jednostek tworzących kolonie na mililitr.

3. Reprezentatywne wyniki

Procedurę CLP przeprowadzono początkowo u myszy szczepu C57BL/6. Przetestowano kilka parametrów w celu modulacji ciężkości sepsy poprzez zmianę długości podwiązania oraz grubości igły, co przedstawiono na Rysunkach 1 i 2. spośród tych dwóch czynników długość podwiązania wydaje się być skuteczniejsza niż grubość igły w zmienianiu odsetka przeżywalności. Jak pokazano na Rysunku 1, zwiększenie długości podwiązania o więcej niż 1cm powoduje wzrost śmiertelności do 100% w porównaniu z myszami z podwiązaniem ≤1cm. Zwiększenie grubości igły również obniżyło odsetek przeżywalności ze 100% (przy użyciu igły 22G) do 55% (przy użyciu igły 19G) przy dwóch nakłuciach. Przebadano również wpływ CLP na myszy C57BL/6 oraz 129SvJ, aby ustalić, czy różne szczepy myszy wykazują podobną czy odmienną podatność na sepsę indukowaną przez CLP. Rysunek 3 pokazuje, że w tych samych warunkach myszy 129SvJ były bardziej podatne na infekcję niż C57BL/6, co wskazuje zwiększony odsetek śmiertelności.

figure-protocol-2
Rysunek 1. Wpływ długości podwiązania kątnicy na przeżywalność zwierząt. Procedura CLP została przeprowadzona u myszy C57BL/6 z zastosowaniem dwóch różnych długości podwiązania kątnicy. Ten pojedynczy parametr ma drastyczny wpływ na przeżywalność zwierząt, ponieważ wszystkie zwierzęta w grupie z obszarem podwiązania dłuższym niż 1 cm padły w czasie krótszym niż 3 dni w porównaniu z grupą zwierząt, u których obszar podwiązania wynosił ok. 1 cm (n=8).

figure-protocol-3
Rycina 2. Wpływ grubości igły na przeżywalność. Procedurę CLP przeprowadzono u myszy C57BL/6, stosując dwa różne rozmiary igieł: 19G i 22G. Myszy, u których dokonano perforacji kątnicy za pomocą igły 19G, wykazały przeżywalność na poziomie 55-60%. W przeciwieństwie do nich, myszy z perforacją kątnicy wykonaną igłą 22G wykazały 100% przeżywalności, mimo że w ciągu pierwszych 3-4 dni wystąpiły u nich typowe objawy stanu zapalnego, które ustąpiły po 4 dniach (n=8).

figure-protocol-4
Rysunek 3. Porównanie podatności na sepsę u dwóch różnych szczepów myszy. Model CLP przeprowadzono na myszach szczepów 129SvJ oraz C57BL/6 w tych samych warunkach. Na koniec okresu oceny przeżywalność szczepu 129SvJ była o 25% niższa niż w szczepie C57BL/6, co wskazuje na większą podatność na stan zapalny wywołany infekcją polimikrobową. (n=6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym materiale szczegółowo przedstawiamy sposób wykonania modelu CLP u myszy oraz modulowania stopnia ciężkości zmian.

W porównaniu do innych modeli zwierzęcych sepsy, CLP można przeprowadzić na dowolnej szczepie myszy, niezależnie od wieku i płci. Jest to stosunkowo prosta i niedroga procedura chirurgiczna. W tym modelu stopień ciężkości ma bezpośredni wpływ na odsetek przeżywalności. Długość podwiązania, grubość igły oraz liczba nakłuć to parametry, które można kontrolować w celu mod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals, a protokół został zatwierdzony przez komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt na Uniwersytecie Temple.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była finansowana z grantu przyznanego przez Departament Zdrowia Pensylwanii (Pennsylvania Department of Health).
Dr Miguel Garcia Toscano podczas realizacji niniejszego badania był stypendystą podoktorskim na Uniwersytecie Temple, finansowanym przez Fundację Alfonso Martina Escudero (Alfonso Martin Escudero Foundation).
Pragniemy podziękować Iliyi Yordanovowi oraz Kevinowi Kotredesowi za pomoc w przygotowaniu filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KetaminaKetaset0856-2013-01
KsylazynaAnaSedNADA# 139-236
Strzykawka insulinowa 29GExcel Scientific26028
Szew jedwabny, 6-0 PROLENEEthicon Inc.8680G
Igły 19G i 25GBD Biosciences305186
StrzygarkaGeneral SupplyGeneral supply
Lampka grzewcza na podczerwieńGeneral SupplyGeneral supply
Klamry do ran Michela 7mmRoboz Surgical Instruments Co.RS-9270
Maseczka z pętelkami za uszyFisher Scientific19-130-4181
Nożyczki do sekcjiRoboz Surgical Instruments Co.RS-6702
Roztwór BetadynyVWR international63410-992
Pinceta chirurgicznaRoboz Surgical Instruments Co.RS-5135
Wacik nasączony 70% alkoholem izopropylowymFisher Scientific22-031-350
BuprenorfinaBedford Laboratories55390-100-10
TramadolSigma-Aldrich42965

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
  2. Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. The enigma of sepsis. J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).
  3. Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes. Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).
  4. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
  5. Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
  6. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J Surg Res. 102, 45-49 (2002).
  7. De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis. Shock. 23, 11-17 (2005).
  8. Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis. Cytokine. 14, 162-169 (2001).
  9. Turnbull, I. R. Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture. Shock. 19, 310-313 (2003).
  10. Miyaji, T. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).
  11. Torres, M. B., De Maio, A. An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome. J Surg Res. 125, 88-93 (2005).
  12. Doi, K. AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality. Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).
  13. Wilson, M. A. Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis. J Trauma. 41, 622-627 (1996).
  14. Zanotti-Cavazzoni, S. L. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).
  15. Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34, 250-260 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model sepsysepsa u myszyjama otrzewnap ynoterapiaszew jedwabnyzamkni cie ranyiniekcja znieczulenianak ucie k tnicyprzeciwb lowe leczenie pooperacyjne

Powiązane artykuły