Procedura ligacji i punkcji kątnicy

Podsumowanie

Mysi model podwiązania i perforacji kątnicy jako wartościowe narzędzie do badania sepsy u ludzi.

Streszczenie

Sepsę u ludzi charakteryzuje zestaw reakcji systemowych w odpowiedzi na intensywną i masową infekcję, której organizm gospodarza nie zdołał opanować lokalnie. Obecnie sepsa znajduje się wśród dziesięciu głównych przyczyn śmiertelności na oddziałach intensywnej terapii w USA ¹. W przebiegu sepsy wyróżnia się dwie uznane fazy hemodynamiczne, które mogą na siebie nachodzić. Faza początkowa (hiperdynamiczna) definiowana jest jako masowa produkcja cytokin prozapalnych i reaktywnych form tlenu przez makrofagi i neutrofile, co wpływa na przepuszczalność naczyniową (prowadząc do hipotensji), funkcję serca oraz indukuje zmiany metaboliczne kulminujące w nekrozie tkanek i niewydolności narządowej. W konsekwencji najczęstszą przyczyną zgonów jest ostra niewydolność nerek. Druga faza (hypodynamiczna) to proces przeciwzapalny obejmujący zaburzenia prezentacji antygenów przez monocyty, zmniejszoną proliferację i funkcję limfocytów oraz zwiększoną apoptozę. Stan ten, znany jako immunosupresja lub depresja immunologiczna, gwałtownie zwiększa ryzyko zakażeń wewnątrzszpitalnych i ostatecznie prowadzi do śmierci. Mechanizmy tych procesów patofizjologicznych nie są dobrze scharakteryzowane. Ponieważ obie fazy sepsy mogą powodować nieodwracalne i nieodwracalne uszkodzenia, kluczowe jest określenie stanu immunologicznego i fizjologicznego pacjenta. Jest to główny powód, dla którego wiele leków terapeutycznych okazało się nieskutecznych. Ten sam lek podany na różnych etapach sepsy może działać terapeutycznie, być szkodliwy lub nie wywołać żadnego efektu ^2,3. Aby zrozumieć sepsę na różnych poziomach, niezbędny jest odpowiedni i kompleksowy model zwierzęcy, który odtwarza kliniczny przebieg choroby. Ważne jest scharakteryzowanie mechanizmów patofizjologicznych występujących podczas sepsy oraz kontrolowanie warunków modelu w celu testowania potencjalnych czynników terapeutycznych.

W celu zbadania etiologii sepsy u ludzi badacze opracowali różne modele zwierzęce. Najpowszechniej stosowanym modelem klinicznym jest podwiązywanie i nakłuwanie kątnicy (CLP). Model CLP polega na perforacji kątnicy, co umożliwia przedostanie się treści kałowej do jamy otrzewnej, wywołując nasiloną odpowiedź immunologiczną indukowaną infekcją polimikrobiologiczną. Model ten spełnia klinicznie istotne warunki występujące u ludzi. Podobnie jak u ludzi, myszy poddane procedurze CLP z płynoterapią wykazują pierwszą (wczesną) fazę hiperdynamiczną, która z czasem przechodzi w drugą (późną) fazę hipodynamiczną. Ponadto profil cytokinowy jest podobny do tego obserwowanego w sepsie u ludzi, gdzie występuje zwiększona apoptoza limfocytów (przegląd w ^4,5). Ze względu na liczne i nakładające się mechanizmy zaangażowane w sepsę, badacze potrzebują odpowiedniego modelu sepsy o kontrolowanym stopniu ciężkości, aby uzyskać spójne i powtarzalne wyniki.

Protokół

1. Ligacja i punkcja kątnicy jako model sepsy u myszy w odniesieniu do sepsy u ludzi

W tej procedurze wykorzystano myszy C57BL/6 (w wieku 7-9 tygodni).

1. Znieczul mysz, wstrzykując dootrzewnowo roztwór ketaminy (75mg/kg) i ksylazyny (15mg/kg) w stosunku 1:1. Jako punkt odniesienia, wstrzyknij 30 μl roztworu 1:1 myszy o masie 20 g. Alternatywnie myszy można znieczulić izofluranem drogą wziewną przy użyciu waporyzatora anestezjologicznego.
2. Wygol brzuch myszy i zdezynfekuj obszar, nakładając najpierw roztwór betadyny, a następnie przecierając gazikiem nasączonym 70% alkoholem (numer 1 w poniższej sekwencji zdjęć). Jako alternatywny środek antyseptyczny można zastosować chlorheksydynę. Opcjonalnie: aby utrzymać obszar w czystości, można użyć jałowej chusty operacyjnej.
3. W warunkach aseptycznych wykonaj laparotomię w linii środkowej o długości od 1 do 2 cm i odsłoń kątnicę wraz z przyległym jelitem (2 i 3).
4. Kątnicę należy ciasno podwiązać nicią jedwabną 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon) u jej podstawy poniżej zastawki kręto-kątniczej, a następnie przebić raz lub dwa razy igłą 19G (4 i 5) po tej samej stronie kątnicy. Należy pamiętać, że długość podwiązanej kątnicy, definiowana jako odległość od dystalnego końca kątnicy do punktu podwiązania, określa stopień ciężkości stanu. Odległość >1cm powoduje sepsę wysokiego stopnia, natomiast odległość ≤1 cm powoduje sepsę średniego do niskiego stopnia. Należy również zauważyć, że zastosowanie metody perforacji kątnicy przedstawionej tutaj różni się od standardowej techniki nakłucia na wylot (wprowadzenia igły przez całą szerokość kątnicy). Obie metody niezawodnie prowadzą do takiego samego efektu sepsy. Jednakże jedną z wad techniki nakłucia na wylot jest to, że nie ułatwia ona kontrolowania ilości wydalanych kałków podczas ściskania kątnicy.
5. Następnie kątnicę należy delikatnie ścisnąć, aby z miejsc perforacji wydostała się niewielka ilość kałków (6). Kątnicę wprowadza się z powrotem do jamy otrzewnej, a otrzewną zamyka się szwami jedwabnymi 6.0 (7).
6. Skórę zamyka się klipsami Reflex 7mm (RS-9258, Roboz Surgical Instruments) lub klipsami do ran Michel (7 mm, RS-9270) (8).
7. Przeprowadź resuscytację myszy, wstrzykując podskórnie 1 ml uprzednio ogrzanego 0,9% roztworu soli fizjologicznej za pomocą igły 25G. To działanie w zakresie płynoterapii wywoła hiperdynamiczną fazę sepsy. Ten krytyczny krok jest opisany szerzej w sekcji dyskusji.
8. Opcjonalnie: wstrzyknij podskórnie buprenorfinę (0,05mg/kg masy ciała) lub tramadol (20mg/kg masy ciała) w celu zapewnienia przeciwbólowej opieki pooperacyjnej. Należy pamiętać, że opioidy te mogą hamować oddychanie i lokomocję, a efekty te mogą zostać błędnie zinterpretowane jako objawy sepsy.
9. Zwierzęta umieszcza się tymczasowo na macie grzewczej lub alternatywnie natychmiast przenosi do klatki z dostępem do podczerwieni lampy grzewczej o mocy 150W aż do wybudzenia z narkozy. Czas wybudzania wynosi od 30 min do 1 godziny.
10. Zapewnij swobodny dostęp do pokarmu i wody (hydrożelu) umieszczonych na dnie klatki.
11. Mysz monitoruje się co 12 godzin pod kątem przeżywalności przez jeden do dwóch tygodni lub poddaje eutanazji w różnych punktach czasowych w celu analizy różnych parametrów.

W ramach kontroli projektu eksperymentalnego zwierzęta w grupie pozorowanej zostaną poddane technice laparotomii bez podwiązania i nakłucia.
Od sześciu do 12 godzin po zabiegu chirurgicznym u myszy wystąpi letarg oraz gorączka, piloerekcja, biegunka, kłębienie się i malaise; czyli wszystkie objawy sepsy. Myszy z bardzo ciężką sepsą przed śmiercią mogą niemal nie być w stanie się poruszać i wykazują gwałtowny spadek temperatury ciała. Na tym etapie myszy należy poddać eutanazji, aby uniknąć przedłużonego bólu i cierpienia.

2. Najczęściej analizowane parametry

Aby ocenić wynik procedury, można analizować różne parametry w narządach, ekstraktach komórkowych lub płynach ustrojowych. Próbki mogą być pobierane w różnych odstępach czasu, od 3 godzin do jednego tygodnia po zabiegu chirurgicznym.

1. Przeżywalność myszy.
2. Cytokiny i chemokiny w surowicy, jamie otrzewnowej i ekstraktach z narządów.
   1. Interleukina-6: Produkowana i uwalniana przez monocyty, komórki dendrytyczne, makrofagi, limfocyty B, limfocyty T, granulocyty, komórki tuczne i wiele innych typów komórek. Odgrywa ważną rolę w reakcji ostrej fazy i zapaleniu.
   2. Czynnik martwicy nowotworu-α: Plejotropowa cytokina, która odgrywa centralną rolę w zapaleniu i apoptozie. Produkowana przez monocyty, makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne i fibroblasty.
   3. Interleukina-1β: Produkowana przez monocyty, komórki NK, komórki dendrytyczne, limfocyty B i limfocyty T. Indukuje gorączkę i syntezę białek ostrej fazy.
   4. Interleukina 10: Sprzyja wychwytowi fagocytarnemu i odpowiedziom Th2, ale hamuje prezentację antygenów i prozapalne odpowiedzi Th1.
   5. Interleukina 10: Sprzyja wychwytowi fagocytarnemu i odpowiedziom Th2, ale hamuje prezentację antygenów i prozapalne odpowiedzi Th1.
   6. Monocytowy białkowy czynnik chemotaktyczny-1 (znany również jako CCL2): Rekrutuje monocyty, limfocyty T pamięci i komórki dendrytyczne do miejsc uszkodzenia tkanek i infekcji.
   7. KC (CXCL1): Produkowany przez makrofagi i komórki śródbłonka. Mysi KC jest silnym atraktantem i aktywatorem neutrofili.
   8. RANTES: Chemoatraktant monocytów. Może przyciągać niestymulowane limfocyty T pamięci CD4+/CD45RO+ oraz stymulowane limfocyty T CD4+ i CD8+ o fenotypach naiwnych i pamięci.
   9. Interferon-γ: Wydzielany przez komórki Th1, cytotoksyczne limfocyty T, komórki dendrytyczne i komórki natural killer (NK). Zwiększa prezentację antygenów i aktywność lityczną w makrofagach oraz hamuje aktywność komórek Th2. Sprzyja adhezji i wiązaniu niezbędnemu do migracji leukocytów oraz zwiększa aktywność komórek NK.
   10. Białko grupy wysokiej mobilności B-1: W monocytach jest aktywatorem jądrowego czynnika kappa B poprzez wiązanie się z komórkowym receptorem dla końcowych produktów zaawansowanej glikacji (RAGE), aktywując uwalnianie mediatorów prozapalnych w późnej fazie sepsy.
3. Oznaczanie mieloperoksydazy w narządach jako miara infiltracji neutrofili. Mieloperoksydaza (MPO) to enzym peroksydazowy występujący najobficiej w granulocytach neutrofilnych. Jest to białko lizosomalne magazynowane w ziarnistościach azurofilnych neutrofila. MPO posiada pigment hemowy, który nadaje zielony kolor wydzielinom bogatym w neutrofile, takim jak ropa i niektóre formy śluzu.
4. Obciążenie bakteryjne w narządach i krwiobiegu, mierzone jako liczba jednostek tworzących kolonie na mililitr.

3. Reprezentatywne wyniki

Procedurę CLP przeprowadzono początkowo na myszach szczepu C57BL/6. Przebadaliśmy kilka parametrów w celu modulacji ciężkości sepsy poprzez zmianę długości podwiązania oraz grubości igły, co przedstawiono na Rysunkach 1 i 2. Spośród tych dwóch czynników długość podwiązania wydaje się być skuteczniejsza niż grubość igły w modulowaniu odsetka przeżywalności. Jak pokazano na Rysunku 1, zwiększenie długości podwiązania o ponad 1cm powoduje wzrost śmiertelności do 100% w porównaniu z myszami z podwiązaniem ≤1cm. Zwiększenie grubości igły również zmniejszyło odsetek przeżywalności ze 100% (przy użyciu igły 22G) do 55% (przy użyciu igły 19G) przy dwóch nakłuciach. Przebadaliśmy również wpływ CLP na myszy C57BL/6 i 129SvJ, aby ustalić, czy różne szczepy myszy wykazują podobną czy odmienną podatność na sepsę indukowaną CLP. Rysunek 3 pokazuje, że w tych samych warunkach myszy 129SvJ były bardziej podatne na infekcję niż myszy C57BL/6, co wskazuje zwiększony odsetek śmiertelności.

Rycina 1. Wpływ długości podwiązania kątnicy na przeżywalność zwierząt. CLP wykonano u myszy C57BL/6, stosując dwie różne długości podwiązania kątnicy. Ten pojedynczy parametr drastycznie wpływa na przeżywalność zwierząt, ponieważ wszystkie zwierzęta w grupie z obszarem podwiązania dłuższym niż 1 cm padły w ciągu mniej niż 3 dni w porównaniu z grupą zwierząt, u których obszar podwiązania wynosił ok. 1 cm (n=8).

Rycina 2. Wpływ grubości igły na przeżywalność. Procedurę CLP przeprowadzono u myszy C57BL/6 przy użyciu dwóch różnych rozmiarów igieł: 19G i 22G. U myszy z przebiciem kątnicy za pomocą igły 19G odnotowano przeżywalność na poziomie 55-60%. W przeciwieństwie do nich, myszy z przebiciem kątnicy igłą 22G wykazały 100% przeżywalności, mimo że w ciągu pierwszych 3-4 dni występowały u nich typowe objawy stanu zapalnego, które ustąpiły po 4 dniach (n=8).

Rycina 3. Porównanie podatności na sepsę u dwóch różnych szczepów myszy. Model CLP przeprowadzono na myszach szczepów 129SvJ i C57BL/6 w tych samych warunkach. Na koniec okresu oceny procent przeżywalności szczepu 129SvJ był o 25% niższy niż w przypadku szczepu C57BL/6, co wskazuje na wyższą podatność na stan zapalny wywołany zakażeniem polimikrobowym. (n=6).

Dyskusja

W niniejszym materiale szczegółowo przedstawiamy sposób wykonania modelu CLP u myszy oraz modulowania stopnia ciężkości zmian.

W porównaniu do innych modeli zwierzęcych sepsy, CLP można przeprowadzić na dowolnej szczepie myszy, niezależnie od wieku i płci. Jest to stosunkowo prosta i niedroga procedura chirurgiczna. W tym modelu stopień ciężkości ma bezpośredni wpływ na odsetek przeżywalności. Długość podwiązania, grubość igły oraz liczba nakłuć to parametry, które można kontrolować w celu mod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina	Ketaset	0856-2013-01
Ksylazyna	AnaSed	NADA# 139-236
Strzykawka insulinowa 29G	Excel Scientific	26028
Szew jedwabny, 6-0 PROLENE	Ethicon Inc.	8680G
Igły 19G i 25G	BD Biosciences	305186
Strzygarka	General Supply	General supply
Lampka grzewcza na podczerwień	General Supply	General supply
Klamry do ran Michela 7mm	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-9270
Maseczka z pętelkami za uszy	Fisher Scientific	19-130-4181
Nożyczki do sekcji	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6702
Roztwór Betadyny	VWR international	63410-992
Pinceta chirurgiczna	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135
Wacik nasączony 70% alkoholem izopropylowym	Fisher Scientific	22-031-350
Buprenorfina	Bedford Laboratories	55390-100-10
Tramadol	Sigma-Aldrich	42965