Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

17.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2880

⸱

10 sierpnia 2011

 ,  ,  ,  , 
1Biological and Nanoscale Systems Group, Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee , 3Department of Surgery, Eastern Virginia Medical School, 4Center for Nanophase Materials Sciences Division, Oak Ridge National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Streszczenie

AFM jest narzędziem obrazującym o wysokiej rozdzielczości (skala nm), które mechanicznie bada powierzchnię. Umożliwia obrazowanie komórek i biomolekuł w środowisku ciekłym, bez konieczności chemicznego traktowania próbki. Aby osiągnąć ten cel, próbka musi wystarczająco przylegać do powierzchni montażowej, aby zapobiec jej usunięciu przez siły wywierane przez skanującą końcówkę wspornika AFM. W wielu przypadkach powodzenie obrazowania zależy od unieruchomienia próbki na powierzchni montażowej. Optymalnie unieruchomienie powinno być minimalnie inwazyjne dla próbki, tak aby procesy metaboliczne i cechy funkcjonalne nie zostały naruszone. Poprzez pokrycie świeżo rozłupanych powierzchni miki żelatyną wieprzową, ujemnie naładowane bakterie mogą zostać unieruchomione na powierzchni i obrazowane w cieczy za pomocą AFM. Unieruchomienie komórek bakteryjnych na miki pokrytej żelatyną wynika najprawdopodobniej z oddziaływań elektrostatycznych między ujemnie naładowanymi bakteriami a dodatnio naładowaną żelatyną. Kilka czynników może zakłócać unieruchomienie bakterii, w tym składniki chemiczne cieczy, w której zawieszone są bakterie, czas inkubacji bakterii na miki pokrytej żelatyną, charakterystyka powierzchni szczepu bakteryjnego oraz medium, w którym obrazowane są bakterie. Ogólnie stwierdzono, że zastosowanie miki pokrytej żelatyną jest powszechnie przydatne do obrazowania komórek drobnoustrojów.

Protokół

1. Przygotowanie miki:

  1. Dotnij miki (Electron Microscopy Sciences) nożyczkami do rozmiaru wymaganego przez mikroskop AFM (ok. 2 × 30 mm).
  2. Oddziel warstwy miki z obu stron, zazwyczaj używając taśmy do usunięcia warstwy zewnętrznej, aż pozostaną jedynie gładkie, nienaruszone warstwy.

2. Przygotowanie roztworu żelatyny:

  1. Do butelki laboratoryjnej wlej 10 ml wody destylowanej.
  2. Podgrzewaj butelkę w mikrofalówce, aż woda zacznie wrzeć. (Jeśli kuchenka mikrofalowa nie jest dostępna, wodę można podgrzać w zlewce na płycie grzewczej).
  3. Odważ 0,5 g żelatyny (Sigma G-614, G-2625 lub G-250) i dodaj do gorącej wody destylowanej.
  4. Delikatnie zakręć butelką, aż żelatyna całkowicie się rozpuści.
  5. Ostudź roztwór żelatyny do temperatury 60-70 °C.
  6. Wlej około 15 mL do małej zlewki (20 mL), w której można będzie zanurzyć dociętą łupkę miki.

3. Powlekanie miką:

  1. Zanurz kwadraty miki w podgrzanym roztworze żelatyny i szybko wyjmij, tak aby Mika została pokryta warstwą żelatyny (Rys. 1a).
  2. Po pokryciu natychmiast oprzyj mikę krawędzią o ręcznik papierowy, aby wyschła w powietrzu (Rys. 1b). Mika pokryta żelatyną może być używana przez co najmniej 2 tygodnie. Nadmiar roztworu żelatyny można przechowywać w lodówce i wykorzystać w ciągu około miesiąca, ponownie podgrzewając roztwór stok do temperatury od 60-70 °C. Należy uważać, aby nie doprowadzić do zagotowania żelatyny podczas ponownego podgrzewania.

4. Mocowanie bakterii na powlekanej żelatyną micy:

  1. Odwirować 1 mL kultury bakteryjnej (0,5 - 1,0 OD przy 60 nm) przy prędkości od 80 do 4 50 rcf. W zależności od gatunku bakterii należy zastosować minimalną wartość rcf, która pozwoli na osadzenie komórek w ciągu ok. 5 minut.
  2. Przemyć osad taką samą objętością filtrowanej wody dejonizowanej lub buforu.
  3. Ponownie zebrać komórki poprzez wirowanie.
  4. Bezzwłocznie resuspendować osad w 50 μL nanoprzeciąglej wody dejonizowanej lub buforze. (Zawiesina bakteryjna powinna być widocznie mętna, aby zapewnić odpowiednie stężenie komórek do obrazowania AFM).
  5. Nanieść zawiesinę komórkową (10-20 μL) na mikę pokrytą żelatyną i rozprowadzić na powierzchni za pomocą końcówki pipety (Rys. 1c). Należy zadbać o to, aby podczas nakładania lub rozprowadzania roztworu bakteryjnego końcówka pipety nie dotykała fizycznie powierzchni żelatyny.
  6. Pozostawić powierzchnię na 10 minut, a następnie opłukać strumieniem wody lub buforu (Rys. 1 c-d). Przez cały czas trwania procedury należy dbać o to, aby próbka nie wyschła.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 2 przedstawia przykładowe obrazy komórek bakteryjnych, które zostały zamocowane na powlekanej żelatyną miki i zobrazowane za pomocą AFM. W naszych laboratoriach próbki są zazwyczaj obrazowane przy użyciu mikroskopu sił atomowych PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) wyposażonego w głowicę skanującą 10 μm. Instrument pracuje w rozdzielczości 128-512 pikseli na linię skanu przy prędkości skanowania 0,5-1,0 linii/s. Typowo stosowane są zgłębniki z azotku krzemu Veeco (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) o nominalnych stałych sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,1 nN/nm.

Przygotowanie i nakładanie próbek na szkiełka przedmiotowe do chromatografii przy użyciu mikropipety i pęsety.
Rycina 1. Żelatyna w temperaturze 60-70 °C umieszcza się w zlewce o pojemności 20 ml. Za pomocą pincety świeżo łupane kwadraty miki całkowicie zanurza się w żelatynie (a), a następnie wyjmuje i ustawia pionowo na ręczniku papierowym, opierając je o statyw do mikrocentryfugi (b). Kroplę próbki bakteryjnej nanosi się na mikę i rozprowadza końcówką pipety w kierunkach X i Y (c). Po inkubacji próbki na powierzchni miki przez co najmniej 10 minut, należy opłukać ją strumieniem wody destylowanej. Jeśli immobilizacja przebiegła pomyślnie, na mice pojawi się nieprzezroczysta plamka, jak pokazano na prawym panelu rysunku (d). Jeśli immobilizacja nie powiodła się, otrzymamy przezroczysty fragment miki, jak na panelu lewym. Wielkość nieprzezroczystej plamki na mice jest proporcjonalna do stężenia bakterii w kropli naniesionej na mikę traktowaną żelatyną.

Obraz komórek bakteryjnych na powierzchni wykonany za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM); analiza w nanoskali, badania biologiczne.
Rycina 2. Obrazy AFM wykazujące E. coliNa panelu (a) komórki są osadzone na miki powleczonej żelatyną i obrazowane w 0,05 M PBS. Dla porównania, na panelu (b) przedstawiono obraz komórek bakteryjnych osadzonych na miki powleczonej żelatyną i obrazowanych w powietrzu. Chociaż przegrody są wyraźnie widoczne na obrazie wykonanym w cieczy, w powietrzu można uzyskać wyższą rozdzielczość, o czym świadczy obecność pili (wstawka na panelu (b)).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Różne czynniki mogą wpływać na osadzanie komórek drobnoustrojów i ich obrazowanie za pomocą AFM. Ważne znaczenie ma żelatyna stosowana do powlekania miki. Żelatyna komercyjna jest izolowana z wielu kręgowców, w tym z ryb, krów i świń. Zarówno pochodzenie, jak i metoda przetwarzania determinują przydatność żelatyny do immobilizacji bakterii. W celu oceny skuteczności immobilizacji bakterii przebadano liczne źródła i rodzaje żelatyny [1]. Dwie najskuteczniejsze żelatyny to Sigma G-6144 oraz G-2625. Żelatyny te, pochodzenia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania te są sponsorowane przez Office of Biological and Environmental Research Departamentu Energii USA oraz z funduszy grantowych Commonwealth Health Research Board stanu Wirginia. Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii USA na podstawie kontraktu nr DE-AC05-00OR22725.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigma-AldrichG6144, G2625 lub G2500
Mikroskop sił atomowych PicoPlusAgilent Technologies
Zespoły drgające AFMVeeco Instruments, Inc.MLCT-AUHW

Bibliografia

  1. Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
  2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
  3. Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
  4. Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  5. Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
  6. Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
  7. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
  8. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  9. Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
  10. Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
  11. Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
  12. Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
  13. Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
  14. Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
  15. Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
  16. O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
  17. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  18. Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
  19. Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
  20. Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
  21. Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
  22. Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
  23. Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
  24. Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
  25. Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mika pokryta żelatynąobrazowanie AFMśrodowisko ciekłeżelatyna wieprzowaprzygotowanie mikizawiesina bakteryjnamokra komora AFMprotokół obrazowania
Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.