Method Article

Immobilizacja bakteryjna do obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych

DOI:

10.3791/2880

⸱

August 10th, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Biological and Nanoscale Systems Group, Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee , 3Department of Surgery, Eastern Virginia Medical School, 4Center for Nanophase Materials Sciences Division, Oak Ridge National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą być unieruchomione na mice pokrytej żelatyną i zobrazowane w cieczy za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM to narzędzie do obrazowania o wysokiej rozdzielczości (skala nm), które mechanicznie bada powierzchnię. Ma zdolność obrazowania komórek i biomolekuł w środowisku ciekłym, bez konieczności chemicznej obróbki próbki. Aby osiągnąć ten cel, próbka musi wystarczająco przylegać do powierzchni montażowej, aby zapobiec usunięciu przez siły wywierane przez skanującą końcówkę wspornika AFM. W wielu przypadkach udane obrazowanie zależy od unieruchomienia próbki do powierzchni montażowej. Optymalnie unieruchomienie powinno być minimalnie inwazyjne dla próbki, tak aby procesy metaboliczne i atrybuty funkcjonalne nie były zagrożone. Pokrywając świeżo rozcięte powierzchnie miki żelatyną wieprzową (wieprzową), ujemnie naładowane bakterie mogą zostać unieruchomione na powierzchni i zobrazowane w cieczy przez AFM. Unieruchomienie komórek bakteryjnych na mice pokrytej żelatyną jest najprawdopodobniej spowodowane oddziaływaniem elektrostatycznym między ujemnie naładowanymi bakteriami a dodatnio naładowaną żelatyną. Unieruchomienie bakteryjne może zakłócać kilka czynników, w tym składniki chemiczne cieczy, w której zawieszone są bakterie, czas inkubacji bakterii na mice pokrytej żelatyną, charakterystyka powierzchni szczepu bakteryjnego i pożywka, w której bakterie są obrazowane. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzono, że stosowanie miki pokrytej żelatyną ma ogólne zastosowanie do obrazowania komórek drobnoustrojów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie miki:

  1. Przyciąć mikę (Electron Microscopy Sciences) nożyczkami do rozmiaru niezbędnego do dopasowania do mikroskopu AFM (ok. 22 × 30 mm).
  2. Rozłup mikę po obu stronach, zwykle używając taśmy do usunięcia zewnętrznej warstwy, aż pozostaną tylko gładkie, nieprzerwane warstwy.

2. Przygotowanie roztworu żelatyny:

  1. Dodaj 100 ml wody destylowanej do butelki laboratoryjnej.
  2. Podgrzej butelkę w kuchence mikrofalowej, aż woda zacznie wrzeć. (Jeśli kuchenka mikrofalowa nie jest dostępna, wodę można podgrzać w zlewce na płycie grzejnej.)
  3. Odważ 0,5 grama żelatyny (Sigma G-6144, G-2625 lub G-2500) i dodaj do gorącej wody destylowanej.
  4. Delikatnie obracaj butelką, aż żelatyna całkowicie się rozpuści.
  5. Schłodzić roztwór żelatyny do temperatury 60-70 °C.
  6. Wlać około 15 ml do małej zlewki (20 ml), w której można zanurzyć pokrojoną posiekaną mikę.

3. Powłoka mikowa:

  1. Zanurz kwadraty miki w podgrzanym roztworze żelatyny i szybko wyjmij, aby mika została pokryta (ryc. 1a).
  2. Po pokryciu natychmiast podeprzyj mikę, na krawędzi, na ręczniku papierowym do wyschnięcia w otaczającym powietrzu (rys. 1b). Mikę pokrytą żelatyną można stosować przez co najmniej 2 tygodnie. Nadmiar roztworu żelatyny można przechowywać w lodówce i zużywać przez około miesiąc, po prostu podgrzewając roztwór podstawowy do temperatury 60-70 °C. Należy uważać, aby żelatyna nie gotowała się podczas podgrzewania.

4. Bakterie montażowe na mice pokrytej żelatyną:

  1. Osad 1 ml kultury bakteryjnej (0,5 - 1,0 OD przy 600 nm) przy 800 do 4,500 rcf. W zależności od bakterii użyj minimalnego rcf, który pokryje komórki w ciągu ̃ 5 minut.
  2. Umyj osad w tej samej objętości przefiltrowanej wody dejonizowanej lub buforu.
  3. Ponownie zebrać komórki przez odwirowanie.
  4. Niezwłocznie zawiesić osad w 500 μl nanoczystej wody dejonizowanej lub buforu. (Zawiesina bakteryjna powinna być widocznie mętna, aby uzyskać odpowiednie stężenie komórek do obrazowania AFM).
  5. Nanieść zawiesinę komórek (10-20 μl) na mikę pokrytą żelatyną i rozprowadzić na powierzchni za pomocą końcówki pipety (rys. 1c). Należy uważać, aby nie dotykać fizycznie powierzchni żelatyny końcówką pipety podczas nakładania lub rozprowadzania roztworu bakteryjnego.
  6. Pozostaw powierzchnię na 10 minut i spłucz strumieniem wody lub buforem (rys. 1 c-d). W trakcie całej procedury należy upewnić się, że próbka nie może wyschnąć.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 2 pokazuje przykładowe obrazy komórek bakteryjnych, które zostały zamontowane na mice pokrytej żelatyną i zobrazowane przez AFM. W naszych laboratoriach próbki są zazwyczaj obrazowane za pomocą mikroskopu sił atomowych PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) wyposażonego w głowicę skanującą o średnicy 100 μm. Przyrząd działa z prędkością 128-512 pikseli na linię skanowania przy prędkości skanowania 0,5-1,0 linii/s. Najczęściej stosowanymi wspornikami są sondy z azotku krzemu Veeco (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) o nominalnych stałych sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,1 nN/nm.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Żelatynę w temperaturze 60-70 °C umieszcza się w zlewce o pojemności 20 ml. Za pomocą pęsety świeżo rozcięte kwadraty miki są całkowicie zanurzane w żelatynie (a), wyjmowane i umieszczane pionowo na ręczniku papierowym, opartym o stojak na mikrowirówkę (b). Kroplę próbki bakteryjnej umieszcza się na mice i rozprowadza za pomocą końcówki pipety w obu kierunkach X i Y (c). Po pozostawieniu próbki do inkubacji na powierzchni miki przez co najmniej 10 minut, przepłukać próbkę w strumieniu wody destylowanej. Jeśli unieruchomienie zadziałało, będziesz w stanie zobaczyć nieprzezroczyste miejsce na mice, jak pokazano w prawym panelu (d). Jeśli unieruchomienie nie zadziałało, otrzymasz przezroczysty kawałek miki, jak w lewym panelu. Nieprzezroczysta plama na mice skaluje się do stężenia bakterii w kropelce, którą umieszczasz na mice potraktowanej żelatyną.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Obrazy AFM E. coli. W panelu (a) komórki są zamontowane na mice pokrytej żelatyną i zobrazowane w 0,005 M PBS. Dla porównania, obraz komórek bakteryjnych zamontowanych na mice pokrytej żelatyną i zobrazowanych w powietrzu pokazano w panelu (b). O ile przegrody są wyraźnie widoczne na obrazie zebranym w cieczy, o tyle większą rozdzielczość, na co wskazuje obecność pilusów (panel wstawkowy (b)), można uzyskać w powietrzu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne czynniki mogą wpływać na montowanie komórek drobnoustrojów i obrazowanie za pomocą AFM. Ważna jest żelatyna używana do powlekania miki. Komercyjna żelatyna jest izolowana z wielu kręgowców, w tym ryb, krów i świń. Zarówno pochodzenie, jak i sposób przetwarzania decydują o przydatności żelatyny do unieruchomienia bakteryjnego. Liczne źródła i rodzaje żelatyny oceniano pod kątem ich skuteczności w unieruchamianiu bakterii [1]. Okazało się, że dwie najskuteczniejsze żelatyny to Sigma G-6144 i G-2625. Pochodzące...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania są sponsorowane przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych, Departament Energii Stanów Zjednoczonych oraz przez granty z Virginia's Commonwealth Health Research Board. Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy nr 1. DE-AC05-00LUB22725.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ŻelatynowySigma-AldrichG6144, G2625 lub G2500
Mikroskop sił atomowych PicoPlusWsporniki Agilent Technologies
AFMVeeco Instruments, Inc.MLCT-AUHW

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
  2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
  3. Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
  4. Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  5. Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
  6. Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
  7. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
  8. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  9. Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
  10. Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
  11. Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
  12. Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
  13. Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
  14. Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
  15. Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
  16. O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
  17. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  18. Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
  19. Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
  20. Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
  21. Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
  22. Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
  23. Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
  24. Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
  25. Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyBacterial ImmobilizationGelatin Coated MicaAFM ImagingLiquid EnvironmentPorcine GelatinMica PreparationBacterial SuspensionAFM Wet CellImaging Protocol

Related Articles