Artykuł metodologiczny

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

DOI:

10.3791/2880

⸱

10 sierpnia 2011

 ,  ,  ,  , 
1Biological and Nanoscale Systems Group, Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee , 3Department of Surgery, Eastern Virginia Medical School, 4Center for Nanophase Materials Sciences Division, Oak Ridge National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM jest narzędziem obrazującym o wysokiej rozdzielczości (skala nm), które mechanicznie bada powierzchnię. Umożliwia obrazowanie komórek i biomolekuł w środowisku ciekłym, bez konieczności chemicznego traktowania próbki. Aby osiągnąć ten cel, próbka musi wystarczająco przylegać do powierzchni montażowej, aby zapobiec jej usunięciu przez siły wywierane przez skanującą końcówkę wspornika AFM. W wielu przypadkach powodzenie obrazowania zależy od unieruchomienia próbki na powierzchni montażowej. Optymalnie unieruchomienie powinno być minimalnie inwazyjne dla próbki, tak aby procesy metaboliczne i cechy funkcjonalne nie zostały naruszone. Poprzez pokrycie świeżo rozłupanych powierzchni miki żelatyną wieprzową, ujemnie naładowane bakterie mogą zostać unieruchomione na powierzchni i obrazowane w cieczy za pomocą AFM. Unieruchomienie komórek bakteryjnych na miki pokrytej żelatyną wynika najprawdopodobniej z oddziaływań elektrostatycznych między ujemnie naładowanymi bakteriami a dodatnio naładowaną żelatyną. Kilka czynników może zakłócać unieruchomienie bakterii, w tym składniki chemiczne cieczy, w której zawieszone są bakterie, czas inkubacji bakterii na miki pokrytej żelatyną, charakterystyka powierzchni szczepu bakteryjnego oraz medium, w którym obrazowane są bakterie. Ogólnie stwierdzono, że zastosowanie miki pokrytej żelatyną jest powszechnie przydatne do obrazowania komórek drobnoustrojów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie miki:

  1. Przytnąć mikę (Electron Microscopy Sciences) nożyczkami do rozmiaru dopasowanego do mikroskopu AFM (ok. 22 × 30 mm).
  2. Łupać mikę z obu stron, zazwyczaj używając taśmy do usunięcia zewnętrznej warstwy, aż pozostaną jedynie gładkie, nieprzerwane warstwy.

2. Przygotowanie roztworu żelatyny:

  1. Do kolby laboratoryjnej wlej 100 ml wody destylowanej.
  2. Podgrzewaj kolbę w kuchence mikrofalowej, aż woda zacznie wrzeć. (Jeśli kuchenka mikrofalowa jest niedostępna, wodę można podgrzać w zlewce na płycie grzejnej).
  3. Odważ 0,5 grama żelatyny (Sigma G-6144, G-2625 lub G-2500) i dodaj do gorącej wody destylowanej.
  4. Delikatnie zakręć kolbą, aż żelatyna całkowicie się rozpuści.
  5. Ostudź roztwór żelatyny do 60-70 °C.
  6. Wlej około 15 mL do małej zlewki (20 mL), w której będzie można zanurzyć dociętą, łupaną mikę.

3. Powłoka z miki:

  1. Zanurz kwadraty miki w ogrzanym roztworze żelatyny i szybko wyjmij, tak aby mika została pokryta warstwą żelatyny (Ryc. 1a).
  2. Po pokryciu natychmiast ustaw mikę krawędzią na ręczniku papierowym, aby wyschła w powietrzu (Ryc. 1b). Mika pokryta żelatyną może być przechowywana i używana przez co najmniej 2 tygodnie. Nadmiar roztworu żelatyny można przechowywać w lodówce i wykorzystywać przez około miesiąc, ponownie podgrzewając roztwór stokowy do temperatury od 60-70 °C. Należy uważać, aby żelatyna nie zagotowała się podczas podgrzewania.

4. Mocowanie bakterii na mikach powlekanych żelatyną:

  1. Odwiruj 1 ml hodowli bakteryjnej (OD przy 600 nm wynosząca 0,5–1,0) z prędkością od 800 do 4500 rcf w celu otrzymania osadu. W zależności od rodzaju bakterii należy zastosować minimalną wartość rcf, która pozwoli na osadzenie komórek w ˜ 5 minut.
  2. Przemyj osad taką samą objętością filtrowanej wody dejonizowanej lub buforu.
  3. Ponownie odwirować komórki w celu ich zebrania.
  4. Bezzwłocznie resuspenduj osad w 500 μL wody dejonizowanej Nanopure lub buforu. (Zawiesina bakteryjna powinna być widocznie mętna, aby zapewnić odpowiednie stężenie komórek do obrazowania AFM).
  5. Nanieś zawiesinę komórkową (10-20 μL) na pokrytą żelatyną mikę i rozprowadzić po powierzchni za pomocą końcówki pipety (Rys. 1c). Należy uważać, aby podczas nakładania lub rozprowadzania zawiesiny bakteryjnej nie dotykać fizycznie powierzchni żelatyny końcówką pipety.
  6. Pozostaw powierzchnię na 10 minut, a następnie spłucz strumieniem wody lub buforu (Ryc. 1 c-d). Przez cały czas trwania procedury należy dbać o to, aby próbka nie wyschła.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 2 przedstawia przykładowe obrazy komórek bakteryjnych, które zostały osadzone na powlekanej żelatyną mice i obrazowane za pomocą AFM. W naszych laboratoriach próbki są zazwyczaj obrazowane przy użyciu mikroskopu sił atomowych PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) wyposażonego w głowicę skanującą 100 μm. Przyrząd jest obsługiwany przy rozdzielczości 128-512 pikseli na linię skanowania i prędkości skanowania 0,5-1,0 linii/s. Typowo stosowane są wsporniki Veeco z azotku krzemu (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) o nominalnych stałych sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,1 nN/nm.

figure-protocol-1
Rycina 1. Żelatyna o temperaturze 60-70 °C zostaje umieszczona w zlewce o pojemności 20 ml. Za pomocą pęsety świeżo rozłupane kwadraty miki są całkowicie zanurzone w żelatynie (a), a następnie wyjęte i ustawione pionowo na ręczniku papierowym, opierając się o statyw do mikrocentryfugi (b). Kropla próbki bakteryjnej jest nanoszona na mikę i rozprowadzana końcówką pipety w obu kierunkach, X i Y (c). Po inkubacji próbki na powierzchni miki przez co najmniej 10 minut, należy opłukać próbkę strumieniem wody destylowanej. Jeśli unieruchomienie przebiegło pomyślnie, na mice pojawi się nieprzezroczysta plamka, jak pokazano na prawym panelu (d). Jeśli unieruchomienie nie powiodło się, otrzymany zostanie przejrzysty kawałek miki, jak na lewym panelu. Wielkość nieprzezroczystej plamki na mice jest proporcjonalna do stężenia bakterii w kropli naniesionej na mikę traktowaną żelatyną.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Obrazy AFM E. coli. Na panelu (a) komórki są osadzone na mice pokrytej żelatyną i obrazowane w 0,005 M PBS. Dla porównania, na panelu (b) przedstawiono obraz komórek bakteryjnych osadzonych na mice pokrytej żelatyną i obrazowanych w powietrzu. Choć przegrody są wyraźnie widoczne na obrazie wykonanym w cieczy, w powietrzu można uzyskać wyższą rozdzielczość, co wskazuje obecność pili (wstawka na panelu (b)).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne czynniki mogą wpływać na osadzanie komórek drobnoustrojów i ich obrazowanie za pomocą AFM. Ważne znaczenie ma żelatyna stosowana do powlekania miki. Żelatyna komercyjna jest izolowana z wielu kręgowców, w tym z ryb, krów i świń. Zarówno pochodzenie, jak i metoda przetwarzania determinują przydatność żelatyny do immobilizacji bakterii. W celu oceny skuteczności immobilizacji bakterii przebadano liczne źródła i rodzaje żelatyny [1]. Dwie najskuteczniejsze żelatyny to Sigma G-6144 oraz G-2625. Żelatyny te, pochodzenia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te są sponsorowane przez Office of Biological and Environmental Research Departamentu Energii USA oraz z funduszy grantowych Commonwealth Health Research Board stanu Wirginia. Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii USA na podstawie kontraktu nr DE-AC05-00OR22725.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigma-AldrichG6144, G2625 lub G2500
Mikroskop sił atomowych PicoPlusAgilent Technologies
Zespoły drgające AFMVeeco Instruments, Inc.MLCT-AUHW

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
  2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
  3. Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
  4. Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  5. Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
  6. Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
  7. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
  8. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  9. Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
  10. Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
  11. Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
  12. Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
  13. Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
  14. Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
  15. Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
  16. O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
  17. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  18. Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
  19. Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
  20. Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
  21. Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
  22. Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
  23. Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
  24. Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
  25. Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mika pokryta elatynobrazowanie AFMrodowisko ciek eelatyna wieprzowaprzygotowanie mikizawiesina bakteryjnamokra komora AFMprotok obrazowania

Powiązane artykuły