Indukcja i badanie hipoksji w hodowlach komórkowych

Podsumowanie

W niniejszym materiale proponujemy proste metody indukcji hipoksji w hodowlach komórkowych oraz proste testy służące do oceny stanu hipoksyjnego hodowli.

Streszczenie

Hipoksja jest definiowana jako zmniejszenie lub brak tlenu w organach, tkankach lub komórkach. Spadek ciśnienia parcjalnego tlenu może wynikać z ograniczonej podaży tlenu (przyczyny obejmują niewystarczającą sieć naczyń krwionośnych, wadliwe naczynia krwionośne oraz anemię) lub ze zwiększonego zużycia tlenu w stosunku do jego podaży (wywołanego nagłym wzrostem tempa proliferacji komórek). Hipoksja może mieć charakter fizjologiczny lub patologiczny, jak ma to miejsce w przypadku nowotworów litych. ^1-3, reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżyca itd.… Każda tkanka i każda komórka wykazują różną zdolność adaptacji do tych nowych warunków. Podczas hipoksji czynnik indukowany hipoksją alfa (HIF) ulega stabilizacji i reguluje ekspresję różnych genów, m.in. tych zaangażowanych w angiogenezę lub transport tlenu. ⁴Stabilizacja tego białka jest charakterystyczną cechą hipoksji, dlatego detekcja HIF jest rutynowo wykorzystywana do badania występowania hipoksji. ^5-7.

W niniejszym artykule proponujemy dwie proste metody indukowania hipoksji w hodowlach komórek ssaków oraz proste testy służące do oceny stanu hipoksji tych komórek.

Protokół

1. Hipoksja indukowana roztworem CoCl₂

Sześciowodny chlorek kobaltu(II) (CoCl₂ • 6H₂O, MW=237.9) jest chemicznym induktorem czynnika 1 indukowanego hipoksją.3 ⁸. Produkt ten jest rozpuszczalny w wodzie (100 mg/ml), dając klarowny, czerwony roztwór.

1. Przygotuj 25mM roztwór zapasowy w sterylnej wodzie dd (przygotować bezpośrednio przed użyciem)
2. W celu indukowania hipoksji zastosuj CoCl₂ w końcowym stężeniu 100μM w standardowej pożywce do hodowli komórkowych.
3. Dodaj pożywkę zawierającą CoCl₂ do komórek i inkubuj hodowle przez 24hours w konwencjonalnym inkubatorze (37°C; 5% C0₂).

Powyższe stężenie sprawdza się w przypadku przetestowanych przez nas linii komórkowych, jednak każdą linię komórkową należy przetestować przy różnych stężeniach (w celu ustalenia krzywej zależności od dawki) oraz w różnych czasach inkubacji, aby ograniczyć toksyczność związaną z lekiem i zoptymalizować test.

2. Indukcja hipoksji w modułowej komorze inkubacyjnej

1. Przygotuj co najmniej dwie identyczne hodowle komórkowe (hodowle bliźniacze). Hodowle mogą znajdować się w kolbach, płytkach lub naczyniach hodowlanych. Aby otworzyć komorę, najpierw otwórz dwa białe plastikowe zaciski znajdujące się na rurkach przymocowanych do komory (rurkach służących do wtryskiwania/przepłukiwania gazu hipoksycznego), a następnie ostrożnie otwórz stalowy zacisk pierścieniowy.
2. Zwolnij zacisk. Teraz można zdjąć pokrywę i tace.
3. Umieść hodowlę komórkową w komorze hipoksycznej. W komorze należy również umieścić szalkę Petriego zawierającą sterylną wodę, aby zapewnić odpowiednie nawilżenie hodowli.
4. Umieść „bliźniaczą” hodowlę komórkową w warunkach normoksji jako kontrolę.
5. Upewnij się, że tace są zabezpieczone i nie przesuwają się, a następnie zamknij komorę pokrywą. Prawidłowo ustaw stalowy zacisk pierścieniowy, aby zapewnić szczelne zamknięcie komory, i zamknij go.
6. Aby stworzyć warunki hipoksji, podłącz przewody do „zbiornika hipoksji” zawierającego mieszaninę gazów z 1% O₂. Jeśli do zbiornika podłączony jest przepływomierz, komora zostanie z nim połączona bezpośrednio (zbiornik gazu – przepływomierz – komora). My stosujemy przepływomierz wbudowany w regulator.
7. Ważne jest usunięcie większości, jeśli nie całego tlenu znajdującego się w komorze i w pożywkach; w tym celu przepłucz komorę, otwierając zbiornik gazu przy szybkości przepływu 20 liters per minutes przez 7-10 minutes; następnie szybko wyłącz dopływ gazu i całkowicie zamknij komorę, zamykając oba białe zaciski.
8. Umieść komorę w konwencjonalnym inkubatorze na żądany czas. W przypadku dużych hodowli odczekaj 1- 2 hours, aby pożywki w hodowlach odgazowały, a następnie powtórz przepłukiwanie.
   Powyższe kroki opierają się na zaleceniach producenta (Billups-Rothenberg, Inc). Upewnij się, że zbiornik z gazem jest przez cały czas odpowiednio zabezpieczony.

Uwagi:

• W celu usunięcia O₂ zawartego w pożywce zaleca się ponowne przepłukanie komory gazem po upływie 1-3 godzin.
• W przypadku czasu inkubacji dłuższego niż 48 godzin również zaleca się ponowne przepłukanie komory gazem.
• Czujniki tlenu (elektrody/manometry), które umożliwiają pomiary O₂ zawartego w komórkach/komorze, zapewnią dokładniejszy pomiar zawartości O₂ wewnątrzkomórkowej/w komorze.
• Kulturowanie komórek przez różne okresy czasu w celu stworzenia krzywej czasowej pomogłoby określić optymalny czas ekspresji HIF-1α w konkretnych komórkach.

3. Ocena hipoksji

1. Wykrywanie HIF-1 α metodą western blot.
   1. Ponownie otwórz komorę zgodnie z opisem w sekcji 2.2 i natychmiast umieść hodowle w lodzie.
   2. Zlizuj komórki poddane i niepoddane działaniu hipoksji za pomocą 5% roztworu SDS bezpośrednio w płytkach, następnie przenieś lizat komórkowy do probówek, poddaj sonikacji, odwirowuj szczątki komórkowe i zbierz nadsącz.
   3. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu BCA, przygotuj próbkę, dodając bufor do nakładania i podgrzewając w 95°C przez 5 min.
   4. Przeprowadź elektroforezę białek na 8% żelu SDS-poliakrylamidowym i przenieś je na membrany nitrocelulozowe.
   5. Blokuj membranę w PBS zawierającym 5% odtłuszczonego mleka w proszku i 0,1% Tween 20 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w 4°C przez noc na wytrząsarce.
   6. Przeprowadź immunoblotting przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym monoklonalnym przeciwko HIF-1α (1/600) w tym samym buforze w 4 °C.
   7. Przepłucz 3 razy w PBS zawierającym 0,1% Tween 20 w temperaturze pokojowej po 5 min za każdym razem i inkubuj z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP (1/2000) w PBS + 0,1% Tween 20 przez 45 min.
   8. Przepłucz 3 razy w PBS zawierającym 0,1% Tween 20 w temperaturze pokojowej przez 5 min za każdym razem.
   9. Użyj zestawu Pierce ECL oraz filmu rentgenowskiego, aby uwidocznić prążek białkowy.
2. Element odpowiedzi na hipoksję (HRE).
   HIF-1α reguluje liczne geny (np. VEGF, EPO) poprzez wiązanie się z sekwencją zwaną elementem regulującym hipoksję (HRE). Wykorzystując HRE powiązany z genem markerowym, możliwe jest wykrycie aktywności HIF ⁹. Aby zastosować tę metodę, należy najpierw przeprowadzić transfekcję komórek plazmidem HRE-lucyferaza, stosując metodę transfekcji dostosowaną do używanych komórek. W naszym przypadku zastosowano Lipofectamine 2000. Komórki muszą zostać przetransfekowane co najmniej 4 godziny przed inkubacją w warunkach hipoksji i normoksji. Czas ten pozwala na wniknięcie DNA do komórek, dzięki czemu ten pierwszy etap nie jest zaburzony przez hipoksję. Sygnał lucyferazy jest wykrywany przy użyciu zestawu do analizy lucyferazy (Luciferase Assay Kit).
   1. Inkubuj przetransfekowane HRE komórki w hipoksji w komorze modularnej lub użyj komórek przetransfekowanych HRE inkubowanych z CoCl₂, uwzględniając kontrolę w normoksji.
   2. Po pożądanym czasie inkubacji usuń z komórek pożywkę wzrostową.
   3. Przepłucz komórki w PBS, a następnie usuń PBS.
   4. Dodaj 400μl 1X odczynnika do lizy do naczynia hodowlanego i zeskrob przylegające komórki, a następnie przenieś je do probówki typu mikro.
   5. Odwirowuj szczątki krótką centryfugacją.
   6. Wymieszaj 20μl nadsączu z lizatów komórkowych ze 100μl odczynnika do analizy lucyferazy i zmierz luminescencję za pomocą luminometru.

4. Reprezentatywne wyniki:

W komórkach K562 (ludzka linia komórkowa białaczki) hodowanych przez 2 dni w warunkach niskiego stężenia tlenu, w porównaniu do normoksji, hipoksja indukuje wzrost poziomu białka HIF-1α, co zostało wykryte za pomocą techniki western blot (Rysunek 1).

Przy użyciu zmodyfikowanych komórek 293 (linia komórkowa embrionalnej nerki) z konstruktem HRE-lucyferaza hodowanych w warunkach hipoksji, w komórkach hipoksycznych stwierdzono istotny wzrost aktywności HIF-1α (Rysunek 2).

Rysunek 1: Wzrost poziomu HIF-1α w komórkach w warunkach hipoksji. Komórki K562 hodowano w warunkach normoksji oraz hipoksji (komora hipoksyczna) przez 48 h, a następnie analizowano za pomocą techniki Western blot z użyciem przeciwciała specyficznego dla HIF-1α. Jako kontrolę załadunku wykorzystano przeciwciało specyficzne dla aktyny.

Rysunek 2: Aktywność HIF-1α. Modyfikowane komórki 293 HRE-lucyferaza były hodowane w warunkach hipoksji i normoksji przez 48 h, a następnie poddano je lizie w celu wykrycia sygnału lucyferazy przy użyciu zestawu do analizy lucyferazy i luminometru. Wyniki przedstawiono jako względne jednostki luminescencji (RLU).

Dyskusja

Proliferacja i żywotność komórek w warunkach hipoksji znacznie różnią się w zależności od typu komórek. Należy zatem dostosować liczbę komórek lub liczbę płytek hodowlanych na początku procesu, aby mieć pewność, że uzyska się odpowiednią ilość komórek/białek do przeprowadzonych eksperymentów.

Metoda z użyciem chlorku kobaltu charakteryzuje się tym, że jest niedroga i szybka. Produkt ten naśladuje hipoksję poprzez indukcję HIF-1/3α, lecz może również regulować inne geny; należy upewnić się, że produkt ten jest odpowiedni dla danego projektu, sprawdzając, jakie inne efekty może wywierać na funkcję i fenotyp konkretnych komórek niezależnie od efektu „naśladowania hipoksji”. Innym lekiem stosowanym do naśladowania hipoksji jest mezylan deferoksaminy (DFO, stosowany w końcowym stężeniu 100 μM). Stosowanie tych leków pozwala badaczowi na wielokrotne otwieranie płytki/szalki/kolby hodowlanej bez wpływu na „warunki hipoksyjne”.

Poziom tlenu zawarty w mieszaninie gazowej może się różnić w zależności od przeprowadzanych eksperymentów i rodzajów komórek, ponieważ wartości hipoksji różnią się w zależności od tkanek i typów komórkowych. W rzeczywistości niektóre komórki wykazują hipoksję przy 5% O₂, inne potrzebują mniej niż 1% O₂, aby wystąpił stan hipoksji. Do mieszaniny gazowej dodaje się 5% CO₂ w celu stabilizacji pH kultur; pozostała część gazu to zazwyczaj azot.

Komory hipoksyjne mają tę zaletę, że nie wymagają stosowania leków, które mogłyby zmieniać zachowanie komórek niezależnie od napięcia tlenowego. Jednak nie wszystkie rodzaje eksperymentów można w nich przeprowadzić, ponieważ przy każdym otwarciu do komory przedostaje się tlen, co zmniejsza stopień hipoksji. Należy wziąć ten czynnik pod uwagę w planowaniu doświadczeń; hipoksja/reoxygenacja jest specyficznym stanem, który może wpływać na niektóre typy komórek. Alternatywą jest zastosowanie stacji roboczych do hipoksji (podłączonych do butli z gotowymi mieszankami gazów lub systemów mieszania gazów) bądź większych inkubatorów hipoksyjnych (komór do przetwarzania w warunkach hipoksji z komorą rękawicową), które umożliwiają wymianę mediów i manipulację komórkami w ciągłym środowisku hipoksyjnym. W ciągu ostatniej dekady na rynek wprowadzono różne komory hipoksyjne, które należy dobierać w zależności od zastosowań laboratoryjnych, realizowanych projektów, dostępnej przestrzeni, wymaganej wielkości oraz budżetu. Zawsze należy dbać o prawidłowe użytkowanie i stan techniczny komory, aby zagwarantować odpowiednie warunki hodowli. Generalnie, podczas korzystania z komory, poziom hipoksji można modulować poprzez wybór różnych mieszanek gazowych (np. 1%, 5% lub 10% tlenu).

W odniesieniu do detekcji HIF-1α należy pamiętać, że niektóre linie komórkowe nowotworowe wykazują ekspresję HIF-1α w warunkach normoksji. Dlatego kluczowe jest zastosowanie kontroli normoksji w celu określenia podstawowego poziomu HIF w tych liniach komórkowych. HIF-1α może być obecny w normoksji również w komórkach niezłośliwych po stymulacji komórkowej lub stresie. Może to wystąpić także w przypadku głodzenia komórek, dlatego należy upewnić się, że hodowle komórkowe są odpowiednio odżywiane i utrzymywane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-HIF-1α	Invitrogen	458400
Chlorek kobaltu (II)	Sigma-Aldrich	C8661-25G
Komora inkubatora	Billups-Rothenberg, Inc.	MIC-101
Plazmid HRE-Luciferase	Addgene	Plasmid 26731