Mikrojontoforeza polega na przemieszczaniu jonów z mikropipety w odpowiedzi na różnicę potencjałów elektrycznych między wnętrzem a zewnętrzem mikropipety. Dzięki temu cząsteczki biologicznie czynne są dostarczane proporcjonalnie do natężenia prądu elektrycznego. Przedstawiamy mikrojontoforezę acetylocholiny w połączeniu z mikromanipulacją w celu zbadania rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka w mikrokrążeniu.
Artykuł metodologiczny
Mikrojontoforeza i mikromanipulacja w obrazowaniu fluorescencyjnym mikrokrążenia in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrojonteforeza polega na przepływie prądu przez końcówkę mikropipety w celu dostarczenia substancji rozpuszczonej do wyznaczonego miejsca w preparacie eksperymentalnym. Mikrojonteforeza może symulować przekaźnictwo synaptyczne1 poprzez powtarzalne dostarczanie neuroprzekaźników i neuropeptydów do neuronów2. Pomijalne przemieszczenie objętości cieczy zapobiega zakłóceniom mechanicznym preparatu eksperymentalnego. Adaptacja tych technik do badania mikrokrążenia3 umożliwiła badanie mechanizmów rozszerzania i kurczenia naczyń na poziomie mikroskopowym in vivo4,5. Kluczową zaletą tak zlokalizowanego dostarczania jest możliwość badania odpowiedzi naczynioruchowych w określonych miejscach sieci mikronaczyniowej bez wywoływania systemicznych lub odruchowych zmian ciśnienia krwi i przepływu krwi w tkankach, co pozwala na ujawnienie wewnętrznych właściwości mikronaczyń.
Ograniczeniem mikroiontoforezy jest trudność w dokładnym określeniu stężenia substancji dostarczonej do badanego miejsca6. Niemniej jednak jej uwalnianie z końcówki mikropipety jest proporcjonalne do natężenia i czasu trwania prądu wyrzutu2,7, dzięki czemu w określonych warunkach eksperymentalnych (opisanych poniżej) można łatwo wyznaczyć powtarzalne zależności między bodźcem a odpowiedzią. Dodatkowe czynniki wpływające na dostarczanie metodą mikroiontoforezy obejmują stężenie substancji rozpuszczonej oraz jej jonizację w roztworze. Średnica wewnętrzna końcówki mikropipety powinna wynosić ˜ 1 μm lub mniej, aby zminimalizować „wyciek” dyfuzyjny, któremu można przeciwdziałać za pomocą prądu utrzymującego. W związku z tym prąd zewnętrzny (dodatni) jest wykorzystywany do wyrzutu kationu, a prąd ujemny do jego zatrzymania wewnątrz mikropipety.
Wytwarzanie mikropipet ułatwiają zaawansowane elektroniczne wyciągacze8. Mikropipety są wyciągane z szklanych rurek kapilarnych zawierających włókno, które „zasysa” roztwór do końcówki mikropipety podczas napełniania od tyłu (tzw. backfilling). Odbywa się to poprzez włożenie mikrokapilary połączonej ze strzykawką zawierającą odpowiedni roztwór i wtryśnięcie go do światła mikropipety. Mikromanipulatory umożliwiają precyzyjne rozmieszczenie mikropipet w preparacie doświadczalnym. Mikromanipulatory zamontowane na ruchomej podstawie mogą być ustawiane wokół preparatu zgodnie z topografią sieci mikronaczyniowych (opisaną poniżej).
Niniejszy protokół demonstruje mikrojontoforezę acetylocholiny (ACh+ Cl-) do tętniczki w preparacie mięśnia opuszkowego myszy (patrz powiązany protokół: JoVE ID#2874) w celu wywołania rozkurczu naczyń zależnego od śródbłonka. Podawanie bodźca jest zsynchronizowane z cyfrową akwizycją obrazu za pomocą wyzwalacza elektronicznego. Zastosowanie myszy transgenicznych Cx40BAC-GCaMP29 umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowych odpowiedzi wapniowych leżących u podstawy rozkurczu naczyń w komórkach śródbłonka tętniczek w żywym mikrokrążeniu.
Protokół
1. Opieka nad zwierzętami i ich wykorzystanie
Po przejrzeniu i zatwierdzeniu przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC), wykorzystuje się samce myszy w wieku co najmniej 12 tygodni. Myszy poddaje się znieczuleniu za pomocą pentobarbitalu sodowego (60 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie doszpczewnowe (i.p.). W trakcie procedur chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych znieczulenie podtrzymuje się za pomocą dawek uzupełniających (10-20% dawki początkowej, i.p.) w razie potrzeby (co 30-60 minut; wskaźnikiem jest reakcja wycofania po uciśnięciu palca u nogi lub ogona). Po zakończeniu procedury eksperymentalnej myszy podaje się przedawkowanie pentobarbitalu (i.p.) i poddaje eutanazji poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.
2. Mikropipety i mikroiontoforeza
- Mikropipety do mikrojontoforezy (wewnętrzna średnica końcówki ˜1 μm) przygotowuje się z kapilar z borokrztanowego szkła przy użyciu poziomego wyciągacza pipet. Nasze pipety mają zwężenie o długości ˜5 mm w celu zapewnienia sztywności; dłuższe zwężenia są bardziej elastyczne.
- Mikropipety są napełniane od tyłu 1M ACh (Rysunek 1A-C) rozpuszczonym w wodzie 18,2 MΩ. Do napełniania od tyłu używa się kapilary połączonej z filtrem 0,2 μm sprzężonym ze strzykawką zawierającą interesującego nas agonistę (Rysunek 1). Można je łatwo wykonać samodzielnie (poniżej) lub zakupić u komercyjnych dostawców. Kapilara jest wkładana do tylnego końca mikropipety, a roztwór ACh jest wprowadzany do światła pipety podczas wycofywania kapilary w miarę napełniania mikropipety. Trzymając mikropipetę końcówką skierowaną w dół, pęcherzyki powietrza usuwa się poprzez delikatne potrząsanie mikropipetą.
- Mikropipetę mocuje się w uchwycie zamontowanym w mikromanipulatorze (Rysunek 2). Uchwyt posiada srebrny drut łączący roztwór ACh wewnątrz mikropipety z zewnętrznym pinem, który z kolei jest podłączony do dodatniego bieguna programatora do mikrojontoforezy. Drugi srebrny drut, przymocowany do krawędzi preparatu tkankowego, jest połączony z biegunem ujemnym w celu zamknięcia obwodu, gdy końcówka mikropipety zostaje przesunięta do soli fizjologicznej nad preparatem.
- Stosuje się prąd podtrzymujący, aby zapobiec wazodylatacji (lub odpowiedzi fluorescencyjnej), gdy końcówka mikropipety znajduje się obok ściany tętniczki. Prąd podtrzymujący zmienia się w zależności od rozmiaru końcówki mikropipety (średnica wewnętrzna = 1 μm) i stężenia agonisty, ale jest wysoce powtarzalny dla określonych parametrów (używamy ˜200 nA dla 1M ACh, końcówka 1 μm). Prąd podtrzymujący zostaje przerwany w momencie podania prądu wyrzutu za pomocą elektronicznego wyzwalacza (Rysunek uzupełniający 1) zsynchronizowanego z rozpoczęciem akwizycji obrazu.
3. Mikromanipulacja
- Własna platforma dla stolika mikroskopu X-Y została wykonana z ferromagnetycznej stali nierdzewnej. Wymiary platformy (1/8" X 12" X 13") zapewniają wystarczającą przestrzeń do dowolnego rozmieszczenia mikromanipulatorów wokół preparatu eksperymentalnego (Rycina 2A). Mikromanipulatory zamocowane na podstawach magnetycznych (Rycina 2B) umożliwiają pozycjonowanie zgodnie z wymaganiami preparatu. Są one umieszczane bezpośrednio na wykonanej platformie wokół preparatu w celu ustawienia mikropipet w interesujących obszarach (Rycina 2C).
4. Reprezentatywne wyniki
- Przy końcówce mikropipety umieszczonej obok tętniczki zaobserwowano odpowiedź fluorescencyjną na ACh (utrzymując prąd dostosowany tak, aby zapobiec wyciekowi ACh). Poniżej progu stymulacji nie odnotowano żadnego efektu. Jednak wraz ze wzrostem intensywności bodźca, fluorescencja wapnia w komórkach śródbłonka wzrastała na coraz większych odległościach wzdłuż tętniczki, podobnie jak intensywność fluorescencji w miejscu stymulacji (Rycina 3).
Rycina 1. Metoda wypełniania pipet do mikrojontoforezy. A) Kapilara (zielona strzałka) jest zamocowana w złączce zaciskowej (niebieska strzałka) przymocowanej do 0.2 μm filtr (fioletowa strzałka), który następnie zostaje podłączony do strzykawki wypełnionej 1M ACh. B) Rurkę mikrokapilarną wprowadza się do pipety do mikroiontoforezy od tyłu, a następnie wypiera się roztwór, aby wypełnić światło mikropipety. C) Po napełnieniu pipety należy przytrzymać końcówkę i delikatnie stuknąć powyżej zwężenia, aby usunąć pęcherzyki powietrza (czarna strzałka).
Rycina 2. Dedykowana platforma do rozmieszczenia mikromanipulatora. A) Platforma ze stali nierdzewnej o właściwościach ferromagnetycznych została umieszczona na specjalnie dostosowanej podstawie mikroskopu MVX10 wyposażonej w stolik translacyjny X-Y. B) Okrągłe podstawy magnetyczne przymocowane do spodu kompaktowych trójosiowych mikromanipulatorów. C)
Mikromanipulatory rozmieszczone wokół preparatu doświadczalnego (patrz powiązany protokół: JoVE ID#2874) w celu badania konkretnych obszarów zainteresowania. Ich kompaktowy rozmiar i wszechstronność umożliwiają jednoczesne użycie wielu mikropipet.
Rycina 3. Fluorescencja wapnia w tętniczkach. Fluorescencja wapnia w komórkach śródbłonka wyścielających ścianę tętniczki wzrastała wraz z natężeniem bodźca.
Pierwsze trzy panele przedstawiają obrazy odpowiedzi fluorescencyjnych na prąd wyrzutowy o natężeniu A) 250 nA, B) 50 nA oraz C) 10 nA (we wszystkich przypadkach czas trwania impulsu wynosił 50 ms). Odległość, na której zwiększyła się fluorescencja wapnia w komórkach śródbłonka, zaznaczono nawiasami w panelach A-C (ok. 130, 270 i 400 μm, odpowiednio). Linia referencyjna przebiegająca przez arteriolę na każdym panelu wskazuje miejsce, w którym rejestrowano odpowiedzi fluorescencyjne (F/Fo) na ACh w punkcie stymulacji. D) Zapisy F/Fo w funkcji czasu dla zwiększających się bodźców ACh. Wraz ze wzrostem prądu wyrzutu amplituda i czas trwania F/Fo ulegały zwiększeniu. Należy zauważyć, że bodziec o natężeniu 10 nA znajdował się poniżej progu i nie wywołał żadnego efektu.
Rysunek uzupełniający 1. Schemat obwodu wyzwalacza elektronicznego. Ten obwód jest połączony z portem równoległym komputera osobistego. Po aktywacji generuje stały impuls TTL o napięciu 5 V. Układ 7805 to stabilizator napięcia 5 V podłączony do zasilacza prądu stałego o napięciu 9–12 V (można użyć baterii o odpowiednim napięciu). Wyjście z układu 7805 zasila czterokanałowy dwukierunkowy przełącznik (Quad Bilateral Switch) oraz wyjście obwodu. Sygnał wejściowy z komputera jest podawany przez rezystor 1 kΩ.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół demonstruje metody przygotowania i stosowania mikropipet do mikroiontoforezy. Podawanie acetylocholiny służy do zilustrowania sygnalizacji wapniowej leżącej u podstaw rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka w tętniczkach znieczulonej myszy. Nasze wyniki pokazują, że odległość, na której ACh zwiększa fluorescencję wapnia w komórkach śródbłonka, rośnie wraz z natężeniem prądu wypychania z mikropipety do mikroiontoforezy (Rysunek 3). Brak wzrostu fluorescencji w warunkach spoczynkowych wskazuje na pomijalny wyciek ACh z mikropipety. Brak odpowiedzi przy natężeniu bodźca 100 nA (Rysunek 3, legenda) ilustruje, że do wzrostu poziomu wapnia w komórkach śródbłonka wymagane jest progowe natężenie stymulacji. Techniki te można łatwo dostosować do innych czynników naczyniokurczowych i preparatów tkankowych.
Kwestie praktyczne: Podczas pracy z mikrojontoforezą w celu badania reaktywności tętniczek należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Choć wyznaczenie rzeczywistego stężenia dostarczonego agonisty okazało się trudne, krzywe odpowiedź-bodziec są powtarzalne w obrębie jednego preparatu, jak i pomiędzy różnymi preparatami. Można je uzyskać, utrzymując stały czas trwania impulsu (np. 500 ms) i zmieniając prąd wyrzutu (np. 250, 500 i 1000 nA; Rysunek 3). Alternatywnie można utrzymać stały prąd wyrzutu (np. 500 nA) i zmieniać czas trwania impulsu (np. 250, 500 i 1000 ms). W celu odniesienia do działania określonego stężenia agonisty preparat można poddać superfuzji odpowiednim roztworem5. Ponieważ siłą napędową wyrzutu substancji rozpuszczonej jest ruch ładunku elektrycznego, substancja dostarczana musi posiadać ładunek netto, aby mogła zostać wypchnięta z mikropipety. Aby zapewnić, że badany czynnik jest głównym nośnikiem ładunku, rozpuszcza się go w wysokim stężeniu (np. 1 M dla ACh), aby zminimalizować elektroosmozę. Jeśli wymaga to manipulacji pH roztworu wypełniającego mikropipetę, konieczne jest zastosowanie kontroli nośnika w celu ustalenia ewentualnych efektów nieswoistych. Należy również przeprowadzić odpowiednie kontrole dla samego przepływu prądu (np. używając mikropipet wypełnionych izotoniczną solą fizjologiczną). Należy ustalić efektywny dystans dyfuzji czynnika z miejsca jego uwalniania, co najłatwiej zrobić empirycznie poprzez obserwację zaniku odpowiedzi fizjologicznej (np. wazodylatacji lub wzrostu stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia po wyrzucie ACh) w miarę ustawiania mikropipety w określonych odległościach od miejsca docelowego. W praktyce efektywny dystans dyfuzji jest w dużym stopniu zależny od tego, jak końcówka mikropipety jest ustawiona w tkance; np. jeśli końcówka zostanie zbyt mocno dociśnięta do tkanki i zostanie zablokowana, wyrzut zostanie upośledzony. Nadmiar tkanki łącznej jest szczególnie problematyczny i powinien zostać usunięty z powierzchni tkanki podczas przygotowania chirurgicznego. Należy również zwrócić uwagę na możliwość wyczerpania zapasu badanego czynnika w końcówce. Minimalizuje się to poprzez stosowanie stosunkowo krótkich impulsów (np. ≤ 1 s). Przy prądach długotrwałych (np. trwających kilka sekund) agonista może być usuwany z końcówki szybciej, niż może zostać uzupełniony drogą dyfuzji z głównego roztworu wypełniającego mikropipetę.
Ponieważ w mikroiontoforezie wypierana jest pomijalna objętość cieczy, w przypadku próby zmiany lokalnego środowiska jonowego (np. w celu podania depolaryzującego bodźca K+), nie można tego skutecznie osiągnąć za pomocą mikroiontoforezy; jest to natomiast łatwo realizowalne poprzez wtryskiwanie pod ciśnieniem większej objętości płynu o pożądanym składzie. Do lokalnej stymulacji tętniczki dobrze sprawdzają się końcówki mikropipet o średnicach wewnętrznych 2-3 μm, przy ciśnieniu wtrysku 4-5 psi (28-35 kPa) i czasie trwania impulsu (np. 1 sekundy) kontrolowanym za pomocą zaworu elektromagnetycznego10. W sytuacjach, gdy wymagane jest ciągłe podawanie substancji z mikropipety na mikro naczynie, preferowane jest wtryskiwanie pod ciśnieniem z użyciem mikropipet o odpowiedniej wewnętrznej średnicy końcówki (np. ˜10 μm)11,12. Kolumna hydrostatyczna o znanej wysokości z zaworem kranikiem zapewnia tani i precyzyjnie określony stały nacisk z możliwością włączania i wyłączania. Szybkość przepływu jest determinowana przez średnicę wewnętrzną końcówki pipety oraz ciśnienie napędzające. Jak zawsze, niezbędne jest zastosowanie kontroli nośnikiem, aby wykluczyć niespecyficzne działanie wtryskiwania pod ciśnieniem.
Oświadczenia
Wszystkie procedury i protokoły z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Missouri i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Produkcja niniejszego artykułu została sponsorowana przez Stanford Photonics.
Podziękowania
Badania w laboratorium autorów są wspierane przez granty National Institutes of Health R37-HL041026, R01-HL086483 oraz R01-HL056786 (SSS) a także przez granty F32-HL097463 i T32-AR048523 (PB) z United States Public Health Service.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kapilary z borokrzemianowego szkła | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| Poziomy wyciągacz pipet | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| Chlorek acetylocholiny | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| adapter do złącza Luer | Martech | AC1343 | Do mocowania mikrokapilar |
| Filtr nylonowy Titan 0,2 μm | Sun Sri | 42204-NN | Niska objętość retencyjna w celu zminimalizowania strat |
| Strzykawka 5 ml | BD Biosciences | 309603 | |
| Uchwyt do pipet | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| Drut srebrny | Warner Instruments | AG10W | średnica 0,25mm |
| 3-osiowy mikromanipulator | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Komponenty manipulatora zgodnie z rysunkiem |
| Programator prądu do mikroiontoforezy | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| Urządzenie wyzwalające | Custom | custom | obwód przedstawiony na ryc. uzupełniającej 1 |
| Płyta ze stali nierdzewnej | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | Zgodnie z projektem |
| Wzmocniona kamera cyfrowa | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Zintegrowana z oprogramowaniem Piper Control |
Bibliografia
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
Przedruki i uprawnienia
