Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórek

Podsumowanie

Opisano metodę opracowania podłoży do hodowli komórkowych z możliwością zmiany topografii w trakcie hodowli. Metoda ta wykorzystuje inteligentne materiały znane jako polimery z pamięcią kształtu, które mają zdolność zapamiętywania kształtu trwałego. Koncepcja ta jest możliwa do zastosowania w szerokim zakresie materiałów i aplikacji.

Streszczenie

Polimery z pamięcią kształtu (SMP) to klasa „inteligentnych” materiałów, które posiadają zdolność zmiany z ustalonego, tymczasowego kształtu do wcześniej zdefiniowanego kształtu trwałego pod wpływem bodźca, takiego jak ciepło^1-5. W typowym cyklu pamięci kształtu polimer SMP jest najpierw deformowany w podwyższonej temperaturze, która jest wyższa od jego temperatury przejścia, T_trans [będącej albo temperaturą topnienia (T_m), albo temperaturą przejścia szklistego (T_g)]. Deformacja ta ma charakter sprężysty i prowadzi głównie do zmniejszenia entropii konformacyjnej łańcuchów sieci tworzących materiał (zgodnie z teorią sprężystości gumowej). Następnie zdeformowany SMP jest schładzany do temperatury poniżej T_trans przy zachowaniu stałego zewnętrznego odkształcenia lub naprężenia. Podczas chłodzenia materiał przechodzi w stan bardziej sztywny (półkrystaliczny lub szklisty), co kinetycznie więzi lub „zamraża” materiał w tym niskoentropowym stanie, prowadząc do makroskopowego utrwalenia kształtu. Odzyskiwanie kształtu jest inicjowane przez ciągłe ogrzewanie materiału powyżej T_trans w warunkach bezstresowych (bez ograniczeń). Pozwalając łańcuchom sieci (które odzyskały ruchliwość) na relaksację do ich termodynamicznie preferowanego stanu maksymalnej entropii, materiał zmienia kształt tymczasowy na kształt trwały.

Komórki są zdolne do badania właściwości mechanicznych otaczającego je środowiska⁶. Mechanizmy, poprzez które oddziaływania mechaniczne między komórkami a ich fizycznym otoczeniem kontrolują zachowanie komórek, stanowią obszar intensywnych badań. Podłoża o zdefiniowanej topografii stały się potężnymi narzędziami w badaniu tych mechanizmów. Wykazano, że wzory topografii podłoża w skali mezo, mikro i nano kierują orientacją komórek, ich adhezją oraz siłami trakcyjnymi^7-14. Wyniki te podkreśliły potencjał topografii podłoża w kontrolowaniu i analizowaniu oddziaływań mechanicznych między komórkami a ich fizycznym środowiskiem podczas hodowli komórkowej, jednak podłoża stosowane do tej pory były zazwyczaj pasywne i nie można było ich zaprogramować tak, aby uległy znacznym zmianom w trakcie hodowli. Ta fizyczna statyczność ograniczała potencjał podłoży topograficznych w kontrolowaniu komórek w hodowli.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono podłoża SMP do aktywnej hodowli komórek (ACC), które wykorzystują powierzchniową pamięć kształtu w celu zaprogramowanej kontroli topografii i odkształcenia podłoża. Podłoża te wykazują zdolność do przejścia z tymczasowej topografii rowkowanej do drugiej, zapamiętanej topografii, która jest niemal płaska. Zmiana ta może być wykorzystana do kontrolowania zachowania komórek w standardowych warunkach hodowli komórkowej.

Protokół

1. Izotermiczne utwardzanie UV NOA63

1. Niestandardową komorę utwardzania wykonano przy użyciu szkiełka przedmiotowego (75 mm x 25 mm x 1 mm), teflonowego dystansera o grubości 1 mm oraz aluminiowej płytki (75 mm x 25 mm x 3 mm), jak pokazano na Rysunku 1. Komora jest utrzymywana w całości za pomocą małych klipsów biurowych.
2. Wstrzyknij NOA63 do komory przez otwór w teflonowym dystanserze, używając igły o rozmiarze 18 G. NOA63 można delikatnie podgrzać, aby ułatwić wstrzykiwanie.
3. Umieść komorę na płycie grzejnej ustawionej na 125 °C i pozostaw do nagrzania do jednolitej temperatury przez 5 min.
4. Wstępnie utwardź NOA63 w komorze z lampą UV (λ_max = 365 nm; patrz Tabela) przez 20 min, przy zachowaniu odległości 6,5 cm lampy od powierzchni szkła.
5. Wyjmij NOA63 z komory, gdy jest jeszcze ciepły, używając żyletki.
6. Dokonaj końcowego utwardzania NOA63 pod światłem UV przez 3 h 40 m na płycie grzejnej w temperaturze 125 °C.
7. Przechowuj NOA63 w warunkach osuszonych w temperaturze -20 °C.

2. Charakterystyka pamięci kształtu NOA63

1. Przygotuj próbkę w kształcie hantla poprzez prasowanie na gorąco utwardzonej folii NOA63 za pomocą dostosowanego wycinaka (patrz Tabela), którego wymiary przedstawiono na Rysunku 2.
2. Umieść próbkę w analizatorze dynamiczno-mechanicznym (DMA; patrz Tabela) z uchwytem do rozciągania. Ustaw instrument w tryb „sterowania siłą” (force controlled), a następnie zaprogramuj procedurę testową w następujący sposób:
   1. Ustabilizuj temperaturę do 95.00 °C
   2. Utrzymuj izotermicznie przez 10.00 min
   3. Zwiększaj siłę w tempie 0.300 N/min do 2.500 N
   4. Utrzymuj izotermicznie przez 5.00 min
   5. Obniżaj temperaturę w tempie 2.00 °C/min do 20.00 °C
   6. Utrzymuj izotermicznie przez 10.00 min
   7. Zmniejszaj siłę w tempie 0.300 N/min do 0.015 N
   8. Utrzymuj izotermicznie przez 5.00 min
   9. Zwiększaj temperaturę w tempie 2.00 °C/min do 95.00 °C
   10. Powtórz kroki 2-9 jeszcze dwa razy

3. Przygotowanie aktywnych podłoży do hodowli komórkowych

1. Poszczególne próbki można przygotować z izotermicznie utwardzonej folii SMP. Przytnąć folię SMP żyletką do pożądanego rozmiaru próbki. Umieścić SMP na płycie grzejnej ustawionej na temperaturę wyższą niż T_g, aby zmniejszyć moduł i ułatwić cięcie.
2. Kształt tymczasowy można utrwalić na kilka różnych sposobów. W tym przypadku używamy laboratoryjnej prasy hydraulicznej z podgrzewanymi/chłodzonymi płytami w celu wytłoczenia tymczasowej topografii. Ustawić temperaturę płyt powyżej T_g.
3. Wytłaczarkę wykonano poprzez utwardzenie żywicy epoksydowej na płycie winylowej. Pozwoli to na uzyskanie tymczasowego kształtu w postaci równoległych rowków. W tym przypadku wytłaczarka miała trójkątne wierzchołki o wysokości od 35 do 40 μm i szerokości 60 μm, rozmieszczone w odstępach 80 μm. Wytłaczarkę można wykonać z innych materiałów i o innej topografii, ale musi być ona sztywniejsza niż NOA63 w temperaturze tłoczenia. Umieścić próbki SMP stroną roboczą do dołu na wytłaczarce, a następnie umieścić próbki wraz z wytłaczarką w prasie.
4. Przyłożyć obciążenie wstępne o wartości ~100 kPa, aby zapewnić kontakt między płytami grzejnymi a próbkami, i utrzymać przez ~5 minut, aby próbki osiągnęły jednorodną temperaturę.
5. Przyłożyć do próbek nacisk 1-6 MPa i utrzymać przez 1 minutę. Naprężenie rzędu 4,7 MPa prowadzi do niepełnego odwzorowania topografii wytłaczarki. Uzyskana tymczasowa topografia ma zaokrąglone wierzchołki o wysokości od 25 do 35 μm i szerokości 150 μm. SMP ulegnie pęknięciu, jeśli zostanie przyłożone większe naprężenie. Przyłożyć mniejsze naprężenia, aby wprowadzić topografie o mniejszych amplitudach.
6. Obniżyć temperaturę poniżej T_g. W tym przypadku wykorzystujemy funkcję chłodzenia wodnego płyt prasy.
7. Gdy temperatura spadnie poniżej T_g, usunąć przyłożoną siłę.
8. Próbki można przechowywać w warunkach osuszonych w temperaturze -20 °C. Przy przechowywaniu w tych warunkach zaobserwowaliśmy spadek odzysku amplitudy o mniej niż 1 μm po dwóch miesiącach dla próbek wytłoczonych za pomocą wytłaczarki z płyty winylowej.

4. Eksperyment z aktywną hodowlą komórkową

1. Światło UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) służy do sterylizacji próbek. Rozmieścić próbki stroną aktywną do dołu w sterylnych naczyniach bez pokrywek i włączyć lampę UV w BSC na 6 h.
2. Przenieść próbki do nowych sterylnych naczyń stroną aktywną do góry. Włączyć lampę UV w BSC na 6 h.
3. Próbki muszą teraz zostać doprowadzone do stanu względnej równowagi przed wysianiem komórek. Umieścić próbki na płytce 96-dołkowej i dodać 150 μl pełnej pożywki wzrostowej.
4. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 30 °C z 5% CO₂ do momentu osiągnięcia pożądanego częściowego powrotu. W tym przypadku zastosowano czas 30 h, aby uzyskać próbki o amplitudzie wystarczająco dużej do wyrównania komórek.
5. Można teraz wysiać komórki na próbki. Przenieść próbki na nową płytkę 96-dołkową.
6. Dodać do próbek 150 μl zawiesiny komórkowej. W tym przypadku zastosowano mysie fibroblasty embrionalne C3H/10T1/2 w stężeniu 20 000 komórek/ml, aby uzyskać izolowane komórki (zazwyczaj niekontaktujące się z innymi komórkami).
7. Aby umożliwić komórkom przytwierdzenie i rozprzestrzenienie się na tymczasowej topografii, inkubować w temperaturze 30 °C przez 9,5 h.
8. W celu analizy morfologii komórek przed przejściem, wyjąć próbki i przeprowadzić ich barwienie oraz obrazowanie fluorescencyjne. Materiał ten wykazuje autofluorescencję w większości zakresu UV i światła widzialnego. Aby zredukować tło, zaleca się stosowanie fluoroforów z dalekiej czerwieni widma, takich jak Alexa Fluor 647.
9. Aby zainicjować powrót próbek, przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i kontynuować hodowlę przez 19 h, aby umożliwić regenerację materiału oraz adaptację morfologii komórek do nowej topografii.
10. Wyjąć próbki, zastosować odpowiedni barwnik (faloidynę do obrazowania aktyny filamentowej) i przeprowadzić procedury obrazowania.

5. Reprezentatywne wyniki:

Utwardzony NOA63 jest przezroczystym, szklistym ciałem stałym o doskonałych właściwościach pamięci kształtu, co pokazano na Rysunku 3. W tym przypadku materiał został utwardzony zgodnie z Protokółem 1 opisanym powyżej i wykazuje jednorodną temperaturę przejścia szklistego T_g wynoszącą 51,1 °C (wyznaczoną na podstawie początku spadku E'). Z jednokierunkowych cykli pamięci kształtu (ogrzewanie, odkształcanie, chłodzenie, powrót, Rysunek 3) wynika, że po odciążeniu w temperaturze 20 °C utrwalił się znaczny procent odkształcenia, co odpowiada wskaźnikowi utrwalenia¹⁵ (R_f) wynoszącemu 89,3% (średnia z trzech cykli; analogicznie poniżej dla R_r). Odkształcenie utrwalone zostało odzyskane ze wskaźnikiem powrotu (R_r) wynoszącym 84,4% w stosunkowo wąskim zakresie temperatur podczas ogrzewania. Ponadto wydajność pamięci kształtu nie uległa pogorszeniu do trzech cykli włącznie, co potwierdza fakt, że wszystkie krzywe niemal dokładnie się pokrywają.

W niniejszym protokole zastosowano NOA63, ponieważ jest on łatwo dostępny u producenta i dostarczany w formie łatwo utwardzalnego, bezrozpuszczalnikowego prepolimeru z fotoinicjatorem. Należy jednak zauważyć, że jego skład nie został ujawniony przez dostawcę. Stwierdzono, że pozwala on na wysoką adhezję oraz przeżywalność komórek. Ponadto temperaturę przejścia można było dostosować tak, aby uzyskać znaczną wartość regeneracji pomiędzy dwiema temperaturami kompatybilnymi z komórkami. W tym protokole można by zastosować szereg innych systemów polimerowych, pod warunkiem, że temperatura ich przejścia jest zgodna z wymaganiami hodowli komórkowej oraz że sprzyjają one adhezji i przeżywalności komórek.

Amplituda tymczasowej topografii (rowków) maleje w czasie w temperaturze 30 °C. Po 30 h w 30 °C amplituda zmniejszyła się o ~50% (Rysunek 4, czas 0)¹⁶. W ciągu kolejnych 9,5 h ulega ona dalszej redukcji o 10%. Gdy proces regeneracji zostaje zainicjowany poprzez zwiększenie temperatury do 37 °C, amplituda zmniejsza się do 0,5% amplitudy początkowej w ciągu 9,5 h. Dla zastosowanego tłocznika i naprężenia tłoczenia wynoszącego 4,9 MPa odpowiada to funkcjonalnej zmianie z rowków o głębokości 13 μm do powierzchni niemal płaskiej.

Przykładem zachowania komórek kontrolowanego za pomocą aktywnych podłoży do hodowli komórkowych jest zmiana organizacji cytoszkieletu. Na tymczasowych podłożach rowkowanych, przed wywołaniem regeneracji, mikrofilamenty aktynowe ustawiają się wzdłuż kierunku rowków (Rycina 5a)¹⁶. Po regeneracji wywołanej wzrostem temperatury mikrofilamenty ulegają reorganizacji i są zorientowane w sposób losowy. Próbki kontrolne posiadające statyczne rowki lub statyczną płaską powierzchnię nie ulegają reorganizacji po podwyższeniu temperatury (Rycina 5b,c).

Rysunek 1: Schemat komory utwardzania NOA63. Widok w przekroju (lewo) oraz widok z góry bez szklanej osłony (prawo).

Rysunek 2: Geometria w kształcie hantla stosowana do charakterystyki objętościowej pamięci kształtu. W: szerokość wąskiej sekcji, L: długość wąskiej sekcji, G: długość pomiarowa, WO: szerokość całkowita, LO: długość całkowita, D: odległość między uchwytami, R: promień zaokrąglenia i RO: promień zewnętrzny.

Rycina 3: Zbiorowy jednokierunkowy efekt pamięci kształtu pojedynczego utwardzenia NOA63, powtórzony 3 razy (gwiazdka oznacza początek eksperymentu). W punkcie oznaczonym gwiazdką polimer został podgrzany, a następnie odkształcony poprzez przyłożenie naprężenia w celu zdefiniowania jego kształtu tymczasowego. Odkształcenie to utrzymywano na stałym poziomie, a temperaturę obniżono, aby utrwalić kształt tymczasowy poniżej T_g polimeru. Następnie zwiększono temperaturę, a materiał powrócił do swojego kształtu trwałego wraz ze zmniejszaniem się odkształcenia tymczasowego.

Rycina 4: Przywrócenie kształtu SMP może zostać wywołane w temperaturach kompatybilnych z hodowlą komórkową. Amplituda wynosząca 25,6 ± 0,8 μm obecna po tłoczeniu powróciła do poziomu 12,6 ± 1,5 μm po 30 h równoważenia w 30 °C (czas 0, czarne kółka). Po przeniesieniu próbek do inkubatora w 37 °C (9,5 h), amplituda powróciła do 1,1 ± 0,2 μm w ciągu 3,5 h. Amplituda powróciła do ~0,3 ± 0,1 μm w ciągu 9,5 h i nie zaobserwowano wykrywalnego spadku w ciągu ostatnich 9,5 h (czerwone trójkąty). Słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe (n = 4-6). Krzywe przedstawiają skany profilometrii stykowej reprezentatywnych próbek.

Rysunek 5: Przebudowa cytoszkieletu aktynowego komórek po przejściu topograficznym. a, Obrazy konfokalne komórek barwionych falloidyną na podłożach tłoczonych wykazują mikrofilamenty wyrównane zgodnie z kierunkiem żłobkowania (biała strzałka) przed przejściem i wzrostem temperatury. Po przejściu mikrofilamenty uległy przebudowie i są zorientowane losowo. b, Komórki na płaskich podłożach kontrolnych wykazują losowo zorientowane mikrofilamenty przed i po wzroście temperatury. c, Komórki na żłobkowanych podłożach kontrolnych wykazują mikrofilamenty wyrównane zgodnie z kierunkiem żłobkowania przed i po wzroście temperatury. Pasek skali wynosi 100 μm. Oznaczenia są zgodne z Rysunkiem 4.

Dyskusja

Temperaturę T_g NOA63 można łatwo kontrolować poprzez temperaturę utwardzania. Wykorzystaliśmy to do wytworzenia podłoży SMP, które mogą być aktywowane w zakresie temperatur kompatybilnym z komórkami. NOA63 ulega plastyfikacji przez wodę, co obniża suchą T_g, dlatego zwiększyliśmy suchą T_g, utwardzając materiał w 125 °C, aby przesunąć zakres mokrej Tg pomiędzy 30 a 37 °C.

Zaprezentowane aktywne podłoża do hodowli komórkowej umożliwiają kontrolowanie zachowania ko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NOA63	Norland Products, Inc.	NOA63	Numer partii 111
Wykrojnik do próbek typu „dogbone”	TestResource, Inc. Shakopee, MN		Zmniejszony próbnik typu IV w kształcie hantla (ASTM D638-03)
Laboratoryjna prasa hydrauliczna	Carver	3851
embrionalne fibroblasty mysie C3H10T1/2	ATCC	CCL-226
Komiczna szafa z laminarnym przepływem powietrza (BSC)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1357
Lampa UV	Spectroline	SB-100PC
Dynamiczny analizator mechaniczny (DMA)	TA Instruments	Q800
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Leica Microsystems	Leica DMI 4000B
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710	obiektyw 20x/0,8 NA (powietrzny) lub 40x/1,30 NA (olejowy)