Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórkowej

Summary

Opisano metodę tworzenia substratów do hodowli komórkowych z możliwością zmiany topografii podczas hodowli. Metoda wykorzystuje inteligentne materiały znane jako polimery z pamięcią kształtu, które mają zdolność zapamiętywania trwałego kształtu. Koncepcja ta można dostosować do szerokiej gamy materiałów i zastosowań.

Abstract

Polimery z pamięcią kształtu (SMP) to klasa "inteligentnych" materiałów, które mają zdolność zmiany ze stałego, tymczasowego kształtu do z góry określonego stałego kształtu po zastosowaniu bodźca, takiego jak ciepło^1-5. W typowym cyklu pamięci kształtu SMP jest najpierw odkształcany w podwyższonej temperaturze, która jest wyższa niż jego temperatura przejścia, T_trans [albo temperatura topnienia (T_m), albo temperatura zeszklenia (T_g)]. Deformacja ma charakter sprężysty i prowadzi głównie do zmniejszenia entropii konformacyjnej składowych łańcuchów sieciowych (zgodnie z teorią sprężystości gumy). Zdeformowany SMP jest następnie schładzany do temperatury poniżej jego T_trans przy zachowaniu stałego odkształcenia zewnętrznego lub naprężenia. Podczas chłodzenia materiał przechodzi w stan sztywny (półkrystaliczny lub szklisty), który kinetycznie zatrzymuje lub "zamraża" materiał w tym stanie o niskiej entropii, prowadząc do makroskopowego utrwalenia kształtu. Odzyskiwanie kształtu jest wyzwalane przez ciągłe podgrzewanie materiału przez T_trans w warunkach bezstresowych (nieograniczonych). Pozwalając łańcuchom sieci (z odzyskaną ruchliwością) zrelaksować się do preferowanego termodynamicznie stanu maksymalnej entropii, materiał zmienia się z tymczasowego kształtu na trwały kształt.

Komórki są zdolne do badania właściwości mechanicznych otaczającego je środowiska⁶. Mechanizmy, za pomocą których mechaniczne interakcje między komórkami i ich środowisko fizyczne kontrolują zachowanie komórek, są obszarami aktywnych badań. Substraty zdefiniowanej topografii okazały się potężnymi narzędziami w badaniu tych mechanizmów. Wykazano, że mezoskalowe, mikroskalowe i nanoskalowe wzorce topografii substratów kierują wyrównaniem komórek, adhezją komórek i siłami trakcyjnymi komórek^7-14. Odkrycia te podkreśliły potencjał topografii substratu w kontrolowaniu i oznaczaniu interakcji mechanicznych między komórkami a ich środowiskiem fizycznym podczas hodowli komórkowej, ale stosowane do tej pory substraty były na ogół pasywne i nie można było ich zaprogramować tak, aby zmieniały się znacząco podczas hodowli. Ten fizyczny zastój ograniczył potencjał substratów topograficznych do kontrolowania komórek w hodowli.

Tutaj wprowadzane są substraty SMP do aktywnej hodowli komórkowej (ACC), które wykorzystują pamięć kształtu powierzchni, aby zapewnić programowaną kontrolę topografii i deformacji substratu. Podłoża te wykazują zdolność do przechodzenia od tymczasowej topografii rowkowanej do drugiej, prawie płaskiej, zapamiętanej topografii. Ta zmiana topografii może być wykorzystana do kontrolowania zachowania komórek w standardowych warunkach hodowli komórek.

Protocol

1. Izotermiczne utwardzanie UV NOA63

1. Niestandardowa komora utwardzania została opracowana przy użyciu szklanego szkiełka (75 mm x 25 mm x 1 mm), teflonowej przekładki o grubości 1 mm i aluminiowej płytki (75 mm x 25 mm x 3 mm), jak pokazano na rysunku 1. Komora jest utrzymywana razem za pomocą małych klipsów do segregatorów.
2. Wstrzyknąć NOA63 do komory przez otwór w przekładce teflonowej za pomocą igły o rozmiarze 18. NOA63 można delikatnie podgrzać, aby ułatwić wstrzykiwanie.
3. Umieść komorę na płycie grzejnej ustawionej na 125 °C i pozwól jej nagrzać się do jednolitej temperatury przez 5 minut.
4. Wstępnie utwardzić NOA63 w komorze lampy UV (λ_max = 365 nm; patrz tabela) przez 20 minut, gdy lampa znajduje się w odległości 6,5 cm od powierzchni szkła.
5. Wyjmij NOA63 z komory, gdy jest ciepły, za pomocą żyletki.
6. Utwardzaj NOA63 w świetle UV przez 3 godziny 40 m na płycie grzejnej w temperaturze 125 °C.
7. Przechowywać NOA63 wysuszony w temperaturze -20 °C.

2. Charakterystyka pamięci kształtu NOA63

1. Przygotuj próbkę hantli poprzez prasowanie na gorąco utwardzonej folii NOA63 za pomocą niestandardowego stempla (patrz tabela), którego wymiary pokazano na rysunku 2.
2. Załadować próbkę do dynamicznego analizatora mechanicznego (DMA; patrz tabela) z uchwytem rozciągającym. Ustaw przyrząd w trybie "sterowania siłą", a następnie zaprogramuj procedurę testowania w następujący sposób:
   1. Równowaga w temperaturze 95,00 °C
   2. Izoterma przez 10.00 min
   3. Siła najazdowa od 0.300 N/min do 2.500 N
   4. Izoterma przez 5,00 min
   5. Rampa od 2,00 °C/min do 20,00 °C
   6. Izoterma przez 10.00 min
   7. Siła rampy 0,300 N/min do 0,015 N
   8. Izoterma przez 5,00 min
   9. Rampa od 2,00 °C/min do 95,00 °C
   10. Powtórz kroki 2-9 jeszcze dwa razy

3. Przygotowanie aktywnych substratów do hodowli komórkowych

1. Pojedyncze próbki mogą być przygotowywane z izotermicznie utwardzanej folii SMP. Przyciąć folię SMP brzytwą do żądanej wielkości próbki. Umieść SMP na płycie grzejnej ustawionej na temperaturę wyższą niż TG, aby zmniejszyć moduł i ułatwić cięcie.
2. Tymczasowy kształt można przymocować na wiele różnych sposobów. W tym przypadku używamy stołowej prasy hydraulicznej z podgrzewanymi/chłodzonymi płytami dociskowymi do wytłaczania tymczasowej topografii. Ustaw temperaturę płyt dociskowych na temperaturę wyższą niż TG.
3. Wytłaczarka została wykonana poprzez utwardzenie żywicy epoksydowej na płycie winylowej. Spowoduje to tymczasowy kształt równoległych rowków. W tym przypadku wytłaczarka miała trójkątne piki o wysokości od 35 do 40 μm i szerokości 60 μm, oddalone od siebie o 80 μm. Wytłaczarka może być wykonana z innych materiałów i o różnej topografii, ale musi być sztywniejsza niż NOA63 w temperaturze tłoczenia. Umieść próbki SMP stroną zadrukowaną do dołu na wytłaczarce i umieść próbki i wytłaczarkę w prasie.
4. Zastosować napięcie wstępne ~100 kPa, aby nawiązać kontakt między płytami grzewczymi a próbkami i przytrzymać przez ~5 minut, aby próbki osiągnęły jednolitą temperaturę.
5. Nanieść 1-6 MPa na próbki i przytrzymać przez 1 minutę. Naprężenie 4,7 MPa prowadzi do niepełnego odtworzenia topografii wytłaczarki. Wytworzona tymczasowa topografia ma zaokrąglone szczyty o wysokości od 25 do 35 μm i szerokości 150 μm. SMP pęknie, jeśli zostanie przyłożone większe naprężenie. Zastosuj mniejsze naprężenia, aby wprowadzić topografie o mniejszych amplitudach.
6. Obniżyć temperaturę poniżej TG. W tym przypadku wykorzystujemy możliwość chłodzenia wodą płyt dociskowych.
7. Gdy temperatura spadnie poniżej T_g, usuń przyłożoną siłę.
8. Próbki można przechowywać w stanie wysuszonym w temperaturze -20 °C. Podczas przechowywania w tych warunkach zaobserwowaliśmy spadek odzysku amplitudy o mniej niż 1 μm po dwóch miesiącach dla próbek wytłaczanych za pomocą wytłaczarki do płyt winylowych.

4. Eksperyment z aktywną hodowlą komórkową

1. Światło UV komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC) służy do sterylizacji próbek. Ułóż próbki stroną zadrukowaną do dołu w sterylnych naczyniach bez pokrywek i włącz światło UV BSC na 6 godzin.
2. Odwróć próbki do nowych sterylnych naczyń stroną zadrukowaną do góry. Włącz światło UV BSC na 6 godzin.
3. Próbki muszą być teraz zrównoważone do względnie stabilnego stanu przed posiewem z komórkami. Umieścić próbki na 96-dołkowej płytce i dodać 150 μl kompletnej pożywki wzrostowej.
4. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 30 °C z 5% CO₂ aż do osiągnięcia pożądanego częściowego odzysku. Tutaj używamy 30 godzin do wytworzenia próbek o wystarczająco dużej amplitudzie, aby wyrównać komórki.
5. Próbki można teraz posiać z komórkami. Umieścić próbki na nowej płytce 96-dołkowej.
6. Do próbek dodać 150 μl roztworu komórkowego. Tutaj używamy mysich fibroblastów embrionalnych C3H/10T1/2 w stężeniu 20 000 komórek/ml, aby uzyskać izolowane komórki (na ogół nie stykające się z innymi komórkami).
7. Aby umożliwić komórkom przyczepienie się i rozprzestrzenienie w tymczasowej topografii, należy umieścić w inkubatorze o temperaturze 30 °C na 9,5 godziny.
8. Aby oznaczyć morfologię komórki przed przejściem, należy usunąć próbki i wykonać barwienie oraz obrazowanie fluorescencyjne próbek. Materiał ten wykazuje autofluorescencję w większości zakresu UV i widzialnego. Fluorofory na dalekim czerwonym końcu spektrum, takie jak Alexa Fluor 647, są zalecane do redukcji tła.
9. Aby skłonić próbki do odzyskania, należy przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C i kontynuować hodowlę przez 19 godzin, aby umożliwić odzyskanie materiału i dostosowanie morfologii komórek do nowej topografii.
10. Usuń próbki i zastosuj odpowiednie barwienie (falloidyna do obrazowania aktyny nitkowej) i procedury obrazowania.

5. Reprezentatywne wyniki:

Utwardzony NOA63 to przezroczysta, szklista bryła, która ma doskonałe właściwości pamięci kształtu, jak pokazano na rysunku 3. W tym przypadku materiał został utwardzony jak w protokole 1 powyżej i wykazuje jednolitą T_g wynoszącą 51,1 °C (oznaczoną od początku spadku E'). Na podstawie jednokierunkowych cykli pamięci kształtu (ogrzewanie, odkształcanie, chłodzenie, odzyskiwanie, rysunek 3) zaobserwowano, że duży procent odkształcenia został ustalony po rozładunku w temperaturze 20 °C, co odpowiada współczynnikowi utrwalenia¹⁵ (R_f) wynoszącemu 89,3% (uśrednionemu dla trzech cykli; to samo poniżej dla R_r). Stałe odkształcenie odzyskuje się przy współczynniku odzysku (R_r) wynoszącym 84,4% w stosunkowo małym zakresie temperatur podczas ogrzewania. Co więcej, wydajność pamięci kształtu nie uległa pogorszeniu do trzech cykli, w tym sensie, że wszystkie krzywe podążają prawie dokładnie względem siebie.

NOA63 został użyty w tym protokole, ponieważ jest łatwo dostępny od producenta i dostarczany jako łatwo utwardzalny prepolimer bez rozpuszczalnika z fotoinicjatorem. Jego skład nie jest jednak ujawniany przez dostawcę. Stwierdzono, że umożliwia wysokie przywiązanie komórek i żywotność. Wreszcie, temperaturę przejścia można dostroić, aby umożliwić znaczącą wielkość odzysku między dwiema temperaturami kompatybilnymi z ogniwami. Szereg innych systemów polimerowych może być również stosowanych z tym protokołem, jeśli temperatura przejścia jest zgodna z hodowlą komórkową i jeśli sprzyjają one adhezji i żywotności komórek.

Amplituda tymczasowej topografii (rowków) zmniejsza się z czasem przy temperaturze 30 °C. Po 30 godzinach w temperaturze 30 °C amplituda zmniejszyła się o ~50% (ryc. 4, czas 0)¹⁶. Zmniejsza się o kolejne 10% w ciągu następnych 9,5 godziny. Gdy odzyskiwanie jest wyzwalane przez zwiększenie temperatury do 37 °C, amplituda zmniejsza się do 0,5% początkowej amplitudy w ciągu 9,5 godziny. W przypadku zastosowanej wytłaczarki i naprężenia wytłaczającego wynoszącego 4,9 MPa odpowiada to funkcjonalnej zmianie rowków o wielkości 13 μm na prawie płaską powierzchnię.

Przykładem zachowania komórki kontrolowanego za pomocą aktywnych substratów hodowli komórkowych jest zmiana w organizacji cytoszkieletu. Na tymczasowych rowkowanych podłożach przed uruchomieniem odzysku mikrofilamenty aktyny wyrównują się wzdłuż kierunku rowków (ryc. 5a)¹⁶. Po odzyskaniu przez wzrost temperatury mikrofilamenty zreorganizowały się i są losowo zorientowane. Próbki kontrolne, które mają statyczne rowki lub statyczną płaską powierzchnię, nie reorganizują się po wzroście temperatury (rysunek 5b,c).

Rysunek 1: Schemat komory utwardzania NOA63. Widok przekroju poprzecznego (po lewej) i widok z góry bez szklanej pokrywy (po prawej).

Rysunek 2: Geometria hantli używana do charakteryzacji pamięci kształtu. W: szerokość wąskiego przekroju, L: długość wąskiego przekroju, G: długość miernika, WO: szerokość całkowita, LO: długość całkowita, D: odległość między uchwytami, R: promień zaokrąglenia, a RO: promień zewnętrzny.

Rysunek 3: Jednokierunkowa pamięć kształtu pojedynczego leku NOA63, powtórzona 3 razy (gwiazdka oznacza początek eksperymentu). W punkcie oznaczonym gwiazdką polimer został podgrzany, a następnie odkształcony przez przyłożenie naprężenia w celu określenia jego tymczasowego kształtu. Odkształcenie to jest utrzymywane na stałym poziomie, a temperatura jest obniżana, aby utrwalić tymczasowy kształt poniżej T_g polimeru. Temperatura jest następnie zwiększana, a materiał powraca do swojego trwałego kształtu, gdy tymczasowe odkształcenie jest zmniejszane.

Rysunek 4: Odzyskiwanie SMP może być uruchomione w temperaturach zgodnych z hodowlą komórkową. Amplituda 25,6 ± 0,8 μm obecna po wytłoczeniu powróciła do 12,6 ± 1,5 μm po 30 godzinach równowagi w temperaturze 30 °C (czas 0, czarne koła). Po przeniesieniu próbek do inkubatora o temperaturze 37 °C (9,5 h), amplituda powróciła do 1,1 ± 0,2 μm w ciągu 3,5 godziny. Amplituda powróciła do ~0,3 ± 0,1 μm w ciągu 9,5 godziny i nie zaobserwowano żadnego wykrywalnego spadku w ciągu ostatnich 9,5 godziny (czerwone trójkąty). Słupki błędu reprezentują jedno odchylenie standardowe (n = 4-6). Ślady są skanami profilometrii kontaktowej reprezentatywnych próbek.

Rysunek 5: Cytoszkielet aktynowy komórki przestawia się po przejściu topograficznym. za, Konfokalne obrazy komórek barwionych falloidyną na wytłaczanych podłożach pokazują mikrowłókna wyrównane w kierunku rowka (biała strzałka) przed przejściem i wzrostem temperatury. Po przejściu mikrofilamenty przegrupowane są zorientowane losowo. b, Komórki na płaskich podłożach kontrolnych wykazują losowo zorientowane mikrowłókna przed i po wzroście temperatury. c, Komórki na rowkowanych podłożach kontrolnych pokazują mikrowłókna wyrównane z kierunkiem rowka przed i po wzroście temperatury. Podziałka wynosi 100 μm. Ślady są jak na rysunku 4.

Discussion

T_g NOA63 można łatwo kontrolować za pomocą temperatury utwardzania. Wykorzystaliśmy to do wygenerowania substratów SMP, które mogą być wyzwalane w zakresie kompatybilnym z komórkami. NOA63 jest uplastyczniany przez wodę, która obniża suchą T_g, więc zwiększyliśmy suchą T_g poprzez utwardzanie w temperaturze 125 °C, aby przesunąć mokry zakres Tg między 30 a 37 °C.

Zademonstrowane aktywne substraty do hodowli komórkowych są w stanie kontrolować zachowanie komórek. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOA63	Norland Products, Inc.	NOA63	Numer partii 111
Dogbone Punch	TestResource, Inc. Shakopee, MN		Zmniejszona kość dogbone typu IV (ASTM D638-03)
Stołowa prasa hydrauliczna	Carver	3851
C3H10T1/2 Mysie fibroblasty embrionalne	ATCC	CCL-226
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1357
Spektrolinia	lampy UV	SB-100PC
Dynamiczny analizator mechaniczny (DMA)	TA Instruments	Q800
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Leica Microsystems Leica	DMI 4000B
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Carl Zeiss, Inc.	Obiektyw olejowy LSM 710	20x/0,8 NA air lub 40x/1,30 NA