Labirynt wodny Morrisa to zadanie behawioralne służące do badania uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa. Jest on szeroko stosowany w badaniach nad neurobiologią, neurofarmakologią oraz zaburzeniami neuropoznawczymi w modelach gryzoni.
Artykuł metodologiczny
Test labiryntu wodnego Morrisa w ocenie deficytów uczenia się i pamięci u myszy w modelu choroby Alzheimera
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Labirynt wodny Morrisa (MWM) został opracowany po raz pierwszy przez neurobiologa Richarda G. Morrisa w 1981 roku w celu badania uczenia się zależnego od hipokampa, w tym nabywania pamięci przestrzennej oraz długotrwałej pamięci przestrzennej 1. MWM jest stosunkowo prostą procedurą, zazwyczaj składającą się z sześciodniowych prób, a jej główną zaletą jest możliwość rozróżnienia między warunkami przestrzennymi (ukryta platforma) a nieprzestrzennymi (widoczna platforma) 2-4. Dodatkowo środowisko testowe MWM ogranicza zakłócenia spowodowane śladami zapachowymi 5. Dzięki temu zadanie to jest szeroko stosowane w badaniach nad neurobiologią i neurofarmakologią uczenia się i pamięci przestrzennej. MWM odgrywa istotną rolę w walidacji modeli gryzoni w zaburzeniach neuropoznawczych, takich jak choroba Alzheimera 6, 7. W niniejszym protokole omówiono typową procedurę MWM służącą do testowania uczenia się i pamięci oraz analizę danych powszechnie stosowaną u myszy transgenicznych będących modelami choroby Alzheimera.
Protokół
1. Przygotowanie
- Przygotowanie sprzętu
- Przygotuj okrągły basen o średnicy 150 cm i głębokości 50 cm (Rys. 1). W przypadku czarnych myszy należy użyć białego basenu; w przypadku białych myszy należy użyć czarnego basenu.
- Zorganizuj pomieszczenie w taki sposób, aby badane zwierzę nie widziało eksperymentatora podczas testu. Można to osiągnąć za pomocą zasłon lub ścianek działowych.
- Rozmieść w pomieszczeniu i/lub na wewnętrznych ściankach basenu (powyżej poziomu wody) wysokokontrastowe wskazówki przestrzenne.
- Umieść w basenie platformę o średnicy 10 cm – białą dla białego basenu, z przezroczystego pleksiglasu dla czarnego basenu. Napełnij basen wodą tak, aby platforma znajdowała się 1 cm nad powierzchnią wody. Pozostaw wodę do osiągnięcia temperatury pokojowej (2 °C). W zależności od temperatury wody może to zająć od jednego do trzech dni; alternatywnie można dodać gorącą wodę, aby przyspieszyć wyrównywanie temperatury.
- Przygotowanie oprogramowania
- Zkalibruj basen w oprogramowaniu komputerowym, aby kamera mogła przeliczać informacje oparte na pikselach na rzeczywiste odległości. Podziel basen na 4 kwadranty. Zdefiniuj strefę platformy jako strefę zmienną, która może zmieniać się przy każdej próbie. Utwórz 5 podstref platformy – jedną w każdym kwadrancie oraz jedną w centrum basenu. Zapisz kalibrację i używaj jej przez pozostałe dni testów (patrz przykład na Rys. 2).
- Ustaw maksymalny czas próby na 60 sec. Jeśli mysz znajdzie platformę przed upływem tego czasu, zaprogramuj oprogramowanie tak, aby zakończyło próbę w momencie znalezienia platformy.
- Skonfiguruj program tak, aby automatycznie rozpoczął śledzenie w momencie, gdy eksperymentator opuści obszar testowy. Skorzystaj z wszelkich dostępnych w oprogramowaniu opcji „minimalizacji odbić”.
- Monitoruj długość ścieżki, czas ucieczki (latencję) oraz czas spędzony w każdym kwadrancie.
2. Dzień 1: Platforma Widoczna
- Program komputerowy
- Wczytaj kalibrację basenu do oprogramowania do śledzenia (tracking software).
- Utwórz 5 prób z przedziałem międzypróbniczym odpowiednim dla Twojego eksperymentu. Zaprogramuj położenie platformy oraz kierunek startowy tak, aby różniły się w każdej próbie. Przykładowy protokół znajduje się w Tabeli 1.
- Procedura testowa
- Przenieś myszy z pomieszczenia hodowlanego do pokoju behawioralnego. Przetrzymaj myszy w obszarze, w którym nie widzą basenu ani wskazówek przestrzennych. Pozwól im zaadaptować się do nowego środowiska przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem testów.
- Umieść na platformie flagę, aby zwiększyć jej widoczność.
- Aby rozpocząć test, podnieś mysz z klatki domowej za nasadę ogona. Podtrzymuj mysz podczas przeniesienia jej do obszaru testowego. Trzymając mysz za nasadę ogona, delikatnie umieść ją w wodzie, skierowaną przodem w stronę krawędzi basenu. Szybko opuść obszar testowy.
- Jeśli mysz znajdzie platformę przed upływem 60 s czasu granicznego, pozwól jej pozostać na platformie przez 5 s, a następnie zwróć ją do klatki domowej. Jeśli mysz nie znajdzie platformy, umieść ją na platformie i pozwól jej pozostać tam przez 20 s przed powrotem do klatki domowej.
- Powtórz procedurę dla wszystkich myszy w grupie. Rozpoczynaj każdą kolejną próbę z innym położeniem platformy i innym kierunkiem startowym, zgodnie z programem w oprogramowaniu.
- Po zakończeniu testów zwróć myszy do pomieszczenia hodowlanego. Przed powrotem do zwierzęca osusz myszy i upewnij się, że odzyskały normotermię.
- W ramach przygotowań na następny dzień usuń flagę z platformy i dolej do basenu wodę tak, aby platforma została zanurzona na 1 cm poniżej powierzchni.
3. Dni 2-5: Platforma ukryta
- Program komputerowy
- Wczytaj kalibrację basenu do oprogramowania śledzącego.
- Utwórz 5 prób z odstępem między próbami odpowiednim dla Twojego eksperymentu. Zaprogramuj położenie platformy tak, aby pozostawało w tej samej pozycji podczas wszystkich prób i dni, ale ustaw inny kierunek startowy dla każdej próby i każdego dnia.
- Procedura testowa
- W przypadku myszy czarnych dodaj do basenu nietoksyczną, białą, proszkową farbę temperową i dokładnie wymieszaj. Użyj takiej ilości farby, aby zanurzona platforma nie była widoczna z powierzchni wody. W przypadku myszy białych należy użyć czarnego basenu z czystą wodą i przezroczystą platformą z pleksiglasu.
- Postępuj zgodnie z krokami 2.2.3 do 2.2.6.
4. Dzień 6: Próba sondująca
- Program komputerowy
- Wczytaj kalibrację basenu do oprogramowania śledzącego.
- Utwórz jedną próbę bez strefy platformy i z jednym kierunkiem startowym. Zaleca się wybrać kierunek startowy najdalej oddalony od kwadrantu platformy wykorzystywanego w dniach 2-5. Ustaw długość próby na 60 sec.
- Procedura testowa
- Usuń platformę z basenu.
- Wykonaj kroki od 2.2.3 do 2.2.6.
5. Analiza danych
- Dla każdego dnia i każdej myszy oblicz średnią z 5 prób, aby uzyskać pojedynczą wartość długości ścieżki oraz latencji ucieczki dla każdego badanego osobnika. Odpowiednio oblicz błąd łączny. W dniu 6. po prostu zbierz dane dotyczące długości ścieżki, latencji ucieczki oraz czasu spędzonego w kwadrancie z platformą dla każdej myszy.
- Jeśli w dniu 1. wystąpią jakiekolwiek różnice między grupami, prawdopodobnie wynikają one z zaburzeń widzenia, a nie z problemów z uczeniem się i pamięcią. Kontynuuj analizę tylko wtedy, gdy w dniu 1. nie stwierdzono żadnych różnic.
- Porównaj krzywe uczenia się dla dni 2-5, stosując testy statystyczne odpowiednie dla Twojego zbioru danych. Stromsza krzywa oznacza szybsze nabywanie umiejętności wykonania zadania; krzywa bardziej płaska wskazuje na deficyt w nabywaniu tych umiejętności. Dane z dnia 2. do dnia 5. analizuje się za pomocą ANOWA.
- W dniu 6. porównaj procent czasu spędzonego w uprzednio wyuczonej kwadrancie z platformą, stosując testy statystyczne odpowiednie dla Twojego zbioru danych. Wyższy procent czasu spędzonego w kwadrancie z platformą interpretuje się jako wyższy poziom retencji pamięci.
6. Reprezentatywne wyniki
Użyliśmy testu labiryntu wodnego Morrisa, aby zbadać wpływ hipoksji na patogenezę AD (7) oraz potencjał farmaceutyczny kwasu walproinowego (VPA) w leczeniu AD (6) u myszy transgenicznych będących modelem AD. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywny wynik, który zgłosiliśmy w naszym badaniu nad wpływem VPA na deficyty pamięci w mysim modelu AD APP23 (6). W dniu 1. (próby z widoczną platformą) nie stwierdzono różnic między grupą leczoną VPA a grupą kontrolną w czasie dotarcia do platformy (Fig. 3A) oraz długości ścieżki (Fig. 3A), co wskazuje, że obie grupy mają podobne zdolności motoryczne i wzrokowe. Na tej podstawie zakładamy, że myszy są w stanie dostrzec oznakowaną platformę oraz punkty orientacyjne w otoczeniu i potrafią prawidłowo pływać. W dniach 2-5 (dni 1-4 prób z ukrytą platformą) przykład wykazuje różnicę w czasie dotarcia do platformy (Fig. 3C) oraz długości ścieżki (Fig 3D) pomiędzy grupami, co sugeruje, że myszy leczone VPA radziły sobie z czasem znacznie lepiej niż grupa kontrolna. Wyniki próby sondy w ostatnim dniu (dzień 6.) pokazują, że liczba przejść myszy do trzeciej ćwiartki, w której wcześniej znajdowała się ukryta platforma, była znacznie większa po zastosowaniu VPA w porównaniu z grupą kontrolną (Fig. 3E). Dane te wskazują, że leczenie VPA znacząco poprawia deficyty pamięci obserwowane u myszy APP23.
Rysunek 1. Konfiguracja sprzętu dla dnia testu z widoczną platformą w labiryncie wodnym Morrisa. Basen jest osłonięty przed eksperymentatorem za pomocą ścianek działowych. Wskazówki przestrzenne znajdują się na ścianach, a w razie potrzeby mogą zostać umieszczone wewnątrz basenu, powyżej lustra wody. Basen jest wypełniony czystą wodą, a platforma znajduje się 1 cm nad powierzchnią. Na platformie umieszczono flagę w celu zwiększenia widoczności.
Rysunek 2. Zrzut ekranu z systemu śledzenia wideo Any-Maze™ przedstawiający kalibrację basenu. Basen jest monitorowany z góry za pomocą analogowej czarno-białej kamery śledzącej z digitalizatorem RTV24. W oprogramowaniu zdefiniowano kilka stref, a cały basen został podzielony na 4 kwadranty. Wprowadzono piątą strefę, strefę platformy, której położenie może się różnić w zależności od próby; możliwe są pięć lokalizacji: NW, NE, SW, SE lub centrum. Dodano linię kalibracyjną (linię z podziałką przechodzącą przez środek), aby umożliwić oprogramowaniu przeliczenie odległości w pikselach na odległości fizyczne.
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki dla labiryntu wodnego Morrisa. Myszy transgeniczne APP23 w wieku 7 miesięcy, niosące ludzki zmutowany gen APP (mutacja szwedzka), zostały przebadane po miesiącu codziennych iniekcji VPA (n=30 myszy) lub roztworu nośnika (n=30 myszy). (A) Podczas pierwszego dnia prób z widoczną platformą, myszy APP23 traktowane VPA oraz grupa kontrolna wykazały podobny czas dotarcia do widocznej platformy.>p < 0,05 testem t studenta. (B) Myszy APP23 traktowane VPA oraz grupa kontrolna wykazały podobne dystanse pływania przed wejściem na platformę widoczną w teście platformy widocznej. P>0,05 testem t studenta. (C) W testach z ukrytą platformą myszy APP23 traktowane kwasem walproinowym (VPA) wykazały krótszy czas ucieczki na ukrytą platformę w 3.rd oraz 4th dzień, P
(D) Myszy APP23 traktowane VPA wykazały krótszą drogę pływania przed ucieczką na ukrytą platformę w 3.rd oraz 4th dzień, P< 0,01 w analizie ANOVA. (E) W próbie badawczej w 6. dniu myszy APP23 traktowane VPA wchodziły do trzeciego kwadrantu, w którym wcześniej znajdowała się ukryta platforma, istotnie częściej niż grupa kontrolna. * P<0,05 testem t studenta. (Adaptacja i przedruk z The Journal of Experimental Medicine 205, 2781-2789, 208, Rockefeller University Press, pierwotnie opublikowano w J. Exp. Med. doi:10.1084/jem.208158.) (6).
| Dzień 1 | Dzień 2 | Dzień 3 | Dzień 4 | Dzień 5 | Dzień 6 | ||
| Położenie platformy | Kierunek początkowy | Położenie platformy: SW Położenie początkowe jak następuje: | Brak platformy. | ||||
| Próba 1 | SW | S | W | N | N | E | N |
| Próba 2 | NW | N | S | W | E | S | |
| Próba 3 | NE | S | N | E | W | W | |
| Próba 4 | Centrum | E | E | W | S | E | |
| Próba 5 | SE | W | S | S | N | N | |
Tabela 1. Przykładowy protokół labiryntu wodnego*
* Zwróć uwagę, że w dniu 1. zmienia się zarówno pozycja platformy, jak i kierunek startowy, podczas gdy w dniach 2-5 pozycja platformy pozostaje stała, a zmienia się jedynie kierunek startowy. W dniu 6. platforma jest nieobecna i przeprowadza się jedną próbę. Kierunek startowy w dniu 6. jest najdalej oddalony od poprzedniej lokalizacji platformy (SW), aby myszy musiały przebyć pewien dystans przed wejściem do kwadrantu, w którym wcześniej znajdowała się platforma.
Dyskusja
Wiek, płeć, gatunek oraz różnice w szczepach wpływają na wyniki w teście MWM (8). Badania wskazują, że myszy w starszym wieku osiągają gorsze wyniki w MWM, natomiast samce gryzoni radzą sobie lepiej niż samice; ponadto zjawisko unoszenia się na wodzie jest bardziej wyraźne u myszy niż u szczurów (9, 10). W związku z tym elementy te powinny być ujednolicone we wszystkich testach. Istnieją również dowody sugerujące, że zwierzęta poddane stresowi osiągają gorsze wyniki w MWM (11), zatem czynniki środowiskowe, które mogą wywoływać stres, takie jak temperatura, światło i hałas, powinny być monitorowane i utrzymywane na stałym poziomie podczas wykonywania zadania.
Oświadczenia
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystania Uniwersytetu Kolumbijskiego w Brytyjskiej Kolumbii (The University of British Columbia Animal Care and Use committee) oraz CIHR.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR), rodzinę Townsend oraz Jack Brown and Family Alzheimer’s Research Foundation (dla W. S.). W. S. jest posiadaczem Canada Research Chair w dziedzinie choroby Alzheimera. P.L. otrzymał wsparcie w ramach NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship Doctoral Research Award oraz stypendium dla starszych studentów studiów doktoranckich z Michael Smith Foundation for Health Research.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System śledzenia wideo AnyMaze | Stoelting Co. | ||
| Farba temperowa | Reeves Poole Groups | Biała, w proszku |
Bibliografia
- Morris, R. G. M. Spatial localization does not require the presence of local cues. Learning and Motivation. 12, 239-260 (1981).
- O'Keefe, J. A review of the hippocampal place cells. Prog Neurobiol. 13, 419-439 (1979).
- Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20, 11-21 (1957).
- Eichenbaum, H., Stewart, C., Morris, R. G. Hippocampal representation in place learning. J Neurosci. 10, 3531-3542 (1990).
- Block, F. Global ischemia and behavioural deficits. Progress in Neurobiology. 58, 279-295 (1999).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. , 18727-18732 (2006).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
- Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris Water Maze in the study of memory and learning. Int J Neurosci. 48, 29-69 (1989).
- Lipp, H. P., Wolfer, D. P. Genetically modified mice and cognition. Curr Opin Neurobiol. 8, 272-280 (1998).
- Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural Plast. 6, 41-52 (1998).
Przedruki i uprawnienia
