Przedstawiamy szczegółowy protokół badania wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie. Do indukowania wyciszania RNA genu GrCLA1 (Cloroplastos alterados 1) bawełny wykorzystano wektory VIGS pochodzące z wirusa TRV (tobacco rattle virus). Albino fenotyp wywołany wyciszeniem GrCLA1 zaobserwowano w stadium siewki w ciągu 2 tygodni po inokulacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza wyciszania genów indukowanego wirusem za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bawełna (Gossypium hirsutum) jest jedną z najważniejszych roślin uprawnych na świecie. Podjęto znaczne wysiłki w zakresie hodowli molekularnej nowych odmian. Wielkoskalowa analiza funkcjonalna genów bawełny pozostaje w tyle za większością nowoczesnych gatunków roślin, prawdopodobnie ze względu na duży rozmiar genomu, duplikacje genów i poliploidię, długi cykl wzrostu oraz trudności w transformacji genetycznej1. Aby ułatwić wysokoprzepustowe badania genetyczne i genomiczne u bawełny, dążymy do opracowania szybkich i wydajnych testów przejściowych do oceny funkcji genów bawełny.
Wyciszanie genów indukowane wirusowo (VIGS) to potężna technika opracowana na podstawie posttranskrypcyjnego wyciszania genów (PTGS) gospodarza w celu hamowania proliferacji wirusów2,3. VIGS zapośredniczony przez Agrobacterium został z sukcesem zastosowany w szerokim zakresie gatunków dwuliściennych, takich jak Solanaceae, Arabidopsis i gatunki strączkowe, a także gatunków jednoliściennych, w tym jęczmienia, pszenicy i kukurydzy, w różnych badaniach genomiki funkcjonalnej3,4. Ponieważ to szybkie i wydajne podejście pozwala uniknąć transformacji roślin i pokonuje redundancję funkcjonalną, jest ono szczególnie atrakcyjne i odpowiednie do badań genomiki funkcjonalnej u gatunków uprawnych, takich jak bawełna, które nie nadają się do transformacji.
W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół systemu VIGS za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie. spośród kilku wirusowych wektorów VIGS, wirus rzęsy tytoniu (TRV) infekuje szerokie spektrum gospodarzy i potrafi intensywnie rozprzestrzenić się w całej roślinie, wywołując jednocześnie łagodne objawy u gospodarzy5. W celu monitorowania wydajności wyciszania, gen GrCLA1, homolog genu Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 (AtCLA1) w bawełnie, został sklonowany i wprowadzony do binarnego wektora VIGS pYL156. Gen CLA1 bierze udział w rozwoju chloroplastów6, a wcześniejsze badania wykazały, że utrata funkcji AtCLA1 prowadzi do powstania fenotypu albinistycznego na liściach właściwych7, co stanowi doskonały marker wizualny dla wydajności wyciszania. Około dwóch tygodni po infiltracji Agrobacterium, na liściach właściwych zaczął pojawiać się fenotyp albinistyczny, przy 100% wydajności wyciszania we wszystkich powtórzonych eksperymentach. Wyciszenie ekspresji genu endogennego zostało również potwierdzone analizą RT-PCR. Co istotne, wyciszanie mogło skutecznie zachodzić we wszystkich testowanych przez nas kultywarach, w tym w różnych odmianach uprawianych komercyjnie w Teksasie. Ten szybki i wydajny test VIGS za pośrednictwem Agrobacterium stanowi bardzo potężne narzędzie do szybkiej, wielkoskalowej analizy funkcji genów na poziomie całego genomu w bawełnie.
Protokół
1. Hodowla siewek bawełny
- Wysiać nasiona bawełny wysokopiennej (Gossypium hirsutum) odmian Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR oraz Deltapine 90 w doniczkach (o średnicy 7 cm) zawierających podłoże Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Doniczki przechowywać w tacy przykrytej plastikową kopułą w temperaturze 23°C, przy natężeniu światła 120 μE m-2 S-1 i fotoperiodzie 12 godzin światła / 12 godzin ciemności w pomieszczeniu wzrostowym.
- Zdjąć kopułę po wykiełkowaniu dwóch liści przysadznych.
- Około dwa tygodnie później wykorzystać rośliny z dwoma w pełni rozwiniętymi liśćmi przysadznymi do testu VIGS. Na tym etapie liście właściwe nie wykształciły się jeszcze (Rysunek 1).
2. Konstrukcja wektora VIGS przenoszącego gen GrCLA1
- Przeprowadzić amplifikację genu Cloroplastos alterados 1 bawełny (GrCLA1) metodą PCR z użyciem starterów GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3' oraz GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3', wykorzystując bibliotekę cDNA z tkanek liści G. raimondii.
- Produkty PCR GrCLA1 poddać trawieniu enzymami EcoRI i KpnI, a następnie wprowadzić do wektora pYL156 (pTRV-RNA2) poprzez ligację.
- Przesiać klony na płytkach z agarem LB zawierającym 50 μg/mL kanamycyny. Zweryfikować konstrukty za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi oraz sekwencjonowania.
- Przenieść plazmid do szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101 metodą elektroporacji i inkubować w celu regeneracji w płynnym medium LB w temperaturze 28°C. Wyselekcjonować transformanty na płytkach z LB+kanamycyną (50 μg/mL) + gentamycyną (25 μg/mL). Bakterie można przechowywać w 25% glicerolu w temperaturze –80°C do długotrwałego użytku.
3. Przeprowadzenie inokulacji VIGS
- Na trzy dni przed inokulacją wysiać metodą kreskową zamrożone zapasy glicerolowe Agrobacterium tumefaciens niosące pYL192 (TRV):RNA1, pYL156 (TRV):RNA2 (sam wektor) oraz pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 na płytki z agarem LB zawierającym 50 μg/mL kanamycyny i 25 μg/mL gentamycyny. Inkubować płytki w temperaturze 28°C przez 24 godziny.
- Na dwa dni przed infiltracją VIGS wybrać pojedynczą kolonię dla każdego konstruktu z powyższych płytek i zaszczepić ją do 5 mL medium LB uzupełnionego o 50 μg/mL kanamycyny i 25 μg/mL gentamycyny; hodować kulturę bakteryjną w temperaturze 28°C przez noc w bębnie obrotowym przy prędkości 50 rpm.
- Przenieść powyższą kulturę do kolby z 50 mL medium LB uzupełnionego o 50 μg/mL kanamycyny i 25 μg/mL gentamycyny, a także 10 mM MES (kwas 2-(4-morfolino)etanosulfonowy) i 20 μM acetosyringonu. Hodować kulturę w temperaturze 28°C przez noc w inkubatorze wytrząsowym przy prędkości 50 rpm.
- Następnego dnia odwirować komórki agro-bakteryjne przy 4000 rpm przez 5 minut; zawiesić kulturę ponownie w buforze do infiltracji zawierającym 10 mM MgCl2, 10 mM MES i 200 μM acetosyringonu. Dostosować OD 600 kultury do wartości 1,5.
- Pozostawić kulturę na blacie w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
- Przed infiltracją agro-bakteryjną nakłuć dolną stronę liści zakotwiczeniowych roślin bawełny igłą 25 G, nie przebijając liści na wylot. W każdej sekcji liścia zakotwiczeniowego wykonano jeden lub dwa otwory (zależnie od miękkości tkanki) (Rysunek 2).
- Zmieszać zawiesinę kultury agro-bakteryjnej pYL192 (TRV):RNA1 oraz pYL156 (TRV):RNA2 lub pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 w stosunku 1:1; infiltrować mieszaninę ręcznie od strony dolnej liści zakotwiczeniowych przez miejsca zranień, używając strzykawki 1 mL bez igły (Rysunek 3).
- Przykryć rośliny plastikową kopułą i pozostawić infiltrowane rośliny w temperaturze pokojowej w warunkach przyćmionego światła przez noc.
- Przenieść rośliny do pomieszczenia wzrostowego o temperaturze 23°C, natężeniu światła 120 μE m-2 S-1 z cyklem 12 godzin światła / 12 godzin ciemności.
Uwaga: VIGS działa, gdy rośliny znajdują się w temperaturze 23°C lub w szklarni (25-28°C). Przy stosunkowo niskiej temperaturze (23 do 25°C) inokulacja jest łatwiejsza, a fenotyp bardziej jednolity w porównaniu z temperaturami wyższymi (28-30°C) lub wahającymi się. Przykrycie roślin kloszem również zwiększa efektywność VIGS.
- Ocenić fenotyp wyciszenia w 7–8 dni po infiltracji. Liście prawdziwe roślin wyciszonych za pomocą pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 zaczęły wykazywać fenotyp albinizmu (Rysunek 4). Rośliny infiltrowane Agrobacterium niosącymi pYL156 (TRV): RNA2 służą jako kontrola.
- Zweryfikować wydajność wyciszania genów poprzez badanie poziomu ekspresji genów endogennych za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), wykorzystując RNA wyizolowane z kontrolnych i wyciszonych roślin bawełny.
Uwaga: Rośliny poddane VIGS należy przechowywać w warunkach kontrolowanej kwarantanny, a po zakończeniu analiz powinny zostać poddane odpowiedniej autoklawacji i utylizacji, ponieważ TRV charakteryzuje się szerokim zakresem gospodarzy i jest patogenem podlegającym obowiązkowi zgłaszania.
4. Reprezentatywne wyniki:
Około dwóch tygodni po infiltracji ręcznej mieszaniną Agrobacterium, na liściach właściwych wyraźnie zaobserwowano fenotyp albinizmu wywołany wyciszeniem GrCLA1. Efektywność wyciszenia osiągnęła prawie 100% w wielu eksperymentach przeprowadzonych na ponad 50 roślinach. Rośliny z wyciszonym genem wykazują jednorodnie rozłożony i bardzo silny fenotyp albinizmu na nowo rozwijających się liściach oraz mozaikę na liściach starszych (Rycina 4).
Rysunek 1. Siewka bawełny w wieku około dwóch tygodni z dwoma w pełni rozwiniętymi liśćmi zasadniczymi, wykorzystana do infiltracji Agrobacterium.
Rycina 2. Wykonywanie niewielkich otworów na spodniej stronie liści zasiedlonych bawełny za pomocą igły 25 G w celu ułatwienia infiltracji Agrobacterium.
Rycina 3. Ręczna infiltracja mieszaniny Agrobacterium do liści zasadniczych bawełny poprzez miejsca zranienia przy użyciu strzykawki bez igły
Rysunek 4. Fenotyp albinizmu wystąpił u roślin bawełny poddanych wyciszaniu VIGS. Przedstawiono cztery odmiany. A) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR; C) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykazano, że VIGS jest potężnym narzędziem w analizie genomiki funkcjonalnej poprzez przejściowe wyciszanie ekspresji genów endogennych. W niniejszym badaniu opracowaliśmy metodę VIGS zapośredniczoną przez Agrobacterium z wykorzystaniem wektora binarnego opartego na TRV. Gen CLA1 (GrCLA1) bawełny został opracowany jako marker wizualny do monitorowania wydajności wyciszania. Konsekwentnie uzyskiwaliśmy 100% wydajności wyciszania genów, co przejawiało się fenotypem albinizmu pojawiającym się na liściach w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni dr. S.P. Dinesh-Kumarowi i dr. Yule Liu za wektory TRV-VIGS, a także dr. Chuckowi Kenerleyowi, Terry'emu Wheelerowi, Jimowi Starrowi oraz firmie Bayer CropScience za udostępnienie nasion bawełny. Praca ta była finansowana przez NSF dla L.S. oraz NIH dla P.H.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bęben obrotowy | Glas-Col | 099A TC108 | Kultura Agro-bacterium |
| Inkubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Kultura Agro-bacterium |
| Spektrofotometr UV/Vis | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Pomiar OD |
| Elektroporator Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Elektroporacja |
| Kontroler impulsora | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Elektroporacja |
| Kuweta do elektroporacji Micropulser | Bio-Rad | 165-2081 | Elektroporacja |
| Strzykawka 1 ml | BD Biosciences | 30962 | Inokulacja agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Wzrost siewek |
| Doniczka terakotowa | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Wzrost siewek |
| MES monohydrat | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Bufor do infiltracji |
| Acetosyringon | Sigma-Aldrich | D134406 | Bufor do infiltracji |
Bibliografia
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
