Opisano metodę pomiaru markerów biochemicznych hipoksji i niedokrwienia u noworodków. Podejście to wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) oraz chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (GC/MS).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Biochemiczny pomiar hipoksji noworodkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Noworodkowe niedotlenienie niedokrwienne charakteryzuje się niewystarczającym ukrwieniem tkanki lub systematycznym brakiem tlenu. Przypuszcza się, że stan ten powoduje lub zaostrza dobrze udokumentowane schorzenia noworodkowe, w tym upośledzenie neurologiczne 1-3. Z powodu braku fosforylacji oksydacyjnej następuje spadek produkcji trifosforanu adenozyny. Aby zrekompensować ten stan deficytu energetycznego, degradowane są cząsteczki zawierające wysokoenergetyczne wiązania fosforanowe 2. Prowadzi to do zwiększenia poziomu adenozyny, która jest następnie degradowana do inozyny, hypoksantyny, ksantyny, a ostatecznie do kwasu moczowego. Dwa ostatnie etapy tego procesu degradacji są przeprowadzane przez ksantynooksydoreduktazę. Enzym ten występuje w formie dehydrogenazy ksantynowej w warunkach normoksji, lecz w warunkach niedotlenienia i reperfuzji ulega przekształceniu w oksydazę ksantynową (XO) 4, 5. W przeciwieństwie do dehydrogenazy ksantynowej, XO wytwarza nadtlenek wodoru jako produkt uboczny degradacji puryn 4, 6. Nadtlenek wodoru ten, w połączeniu z innymi reaktywnymi formami tlenu (ROS) powstającymi podczas niedotlenienia, utlenia kwas moczowy do alantoiny i reaguje z błonami lipidowymi, generując malondialdehyd (MDA) 7-9. Większość ssaków, z wyjątkiem ludzi, posiada enzym urykazę, która przekształca kwas moczowy w alantoinę. U ludzi natomiast alantoina może być tworzona wyłącznie poprzez utlenianie kwasu moczowego zapśredniczone przez ROS. Z tego powodu alantoina jest uważana za marker stresu oksydacyjnego u ludzi, ale nie u ssaków posiadających urykazę.
Opisujemy metody wykorzystujące wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) oraz chromatografię gazową sprzężoną z spektrometrią mas (GCMS) do pomiaru markerów biochemicznych noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia. Do większości badań wykorzystuje się krew ludzką. Można również stosować krew zwierzęcą, biorąc pod uwagę możliwość powstania allantoiny w wyniku działania urykazy.Metabolity puryn powiązano z hipoksją już w 1963 roku, a wiarygodność hypoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego jako biochemicznych wskaźników hipoksji noworodkowej została potwierdzona przez wielu badaczy. 10-13Metoda HPLC stosowana do ilościowego oznaczenia związków purynowych jest szybka, niezawodna i powtarzalna. Metoda GC/MS stosowana do ilościowego oznaczenia allantoiny, stosunkowo nowego markera stresu oksydacyjnego, została opracowana na podstawie metody Grubera i wsp. 7Metoda ta pozwala uniknąć niektórych artefaktów i wymaga niewielkich objętości próbki. Metody stosowane do syntezy MMDA opisano w innym opracowaniu. 14, 15Ilościowe oznaczenie MDA metodą GC/MS zostało zaadaptowane z pracy Paroni. i wsp.oraz Cighetti i wsp.. 16, 17Aktywność oksydazy ksantynowej zmierzono metodą HPLC poprzez ilościowe oznaczenie konwersji pteryny do izoksantopteryny. 18Podejście to okazało się wystarczająco czułe i powtarzalne.
Protokół
1. Pobieranie i przetwarzanie próbek
- Pobrać próbkę krwi do probówki z K3 EDTA o pojemności 6ml, przechowywanej w lodzie.
- W ciągu 2 min od pobrania odwirować próbkę w temperaturze 4°C przy 1500 g przez 10 min.
- Przenieść nadsącz (osocze) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5ml.
- Odwirować w temperaturze 4°C przy 18000 g przez 30 min.
- Pobrać alikwoty nadsączu i przenieść je do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi w celu analizy puryn (200μl), allantoiny (50μl), MDA (100μl) oraz XO (120μl). Należy uważać, aby nie zanieczyścić próbek erytrocytami. Może być konieczne dostosowanie objętości osocza dla MDA, XO i puryn w zależności od całkowitej dostępnej objętości osocza.
2. Przygotowanie standardu wewnętrznego, 2-aminopuryny (2-AP), do analizy puryn i XO
- Odważ 0,01351 g 2-AP i dodaj do 8 ml wody zakwaszonej 2-5 kroplami HCl. Jeśli 2-AP nie rozpuszcza się, należy dodać więcej kwasu. Doprowadź końcową objętość do 10 ml.
- Użyj spektrofotometru UV-Vis, aby wyznaczyć rzeczywiste stężenie przygotowanego roztworu zapasu 2-AP (λmax 315, ε 4000).
- Po wyznaczeniu stężenia roztworu zapasu 2-AP oblicz objętości niezbędne do uzyskania 1x10-7 mol standardu wewnętrznego 2-AP dla pomiarów puryn oraz 1x10-8 mol standardu wewnętrznego 2-AP dla pomiarów XO.
Równanie 1:
Równanie 2:
- Przenieś obliczone objętości do osobnych probówek do mikrocentryfugi i odparuj do suchości w wirówce SpeedVac.
3. Pomiar puryn metodą HPLC
- Przenieś plazmę (200μl) do urządzenia do filtracji odśrodkowej Microcon YM-10 i wiruj w temperaturze 4°C przy 14000 g przez 1,5 godziny.
- Usuń filtrat i przenieś go do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1x10-7 mol 2-AP. Pamiętaj o zapisaniu objętości filtratu dodanego do probówki z 2-AP. Mieszaj próbki na wortexie przez 10-20 s.
- Próbki przeanalizuj za pomocą HPLC. Dla każdej próbki wykonuje się trzy wstrzyknięcia po 50 μl. Próbki wstrzykuje się na kolumnę Supelcosil LC-18-S (15 cm x 4,6 mm, 5 μm) wyposażoną w strażnik kolumny Supelguard LC-18-S. Aby uzyskać odpowiednią separację pików, należy zastosować warunki gradientu opisane w Tabeli 1: rozpuszczalnik A – woda, rozpuszczalnik B – metanol, rozpuszczalnik C – bufor z 50mM mrzeczanu amonu, pH 5,5.
| Czas | Przepływ (ml/min) | %A | %B | %C | |
| 1 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | |
| 2 | 16.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 3 | 17.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 4 | 22.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 5 | 27.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 6 | 32.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 7 | 33.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 8 | 38.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 9 | 39.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 10 | 45.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
Tabela 1. Zmiany rozpuszczalników dla pomiaru związków purynowych metodą HPLC.
- Wyznaczyć stężenie puryn w próbce. Ilościowo określić zawartość hypoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego, wyznaczając powierzchnie pików dla czasów retencji i długości fal opisanych w Tabeli 2. Wyznaczyć powierzchnię piku 2-AP. Obliczyć stosunki powierzchni pików hypoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego do 2-AP, a następnie przeliczyć te stosunki na stężenia w μmol przy użyciu krzywych wzorcowych.
| Czas retencji* | Obserwowane λmax* | Zgłaszane λmax19 | Zgłaszane εmax19 | |
| Kwas moczowy | ~3.5 min | 288 | 283 [2] | 11,500 [2] |
| Hypoksantyna | ~7.0 min | 248 | 248[1] | 10,800 [1] |
| Ksantyna | ~9.5 min | 267 | 267 [2] | 10,200 [2] |
| 2-aminopuryna | ~12.5 min | 305 | 314 [2] | 4,000 [2] |
Tabela 2. Typowe czasy retencji i λmax dla puryn oraz standardu wewnętrznego. *Wyznaczone metodą HPLC przy użyciu izokratycznego buforu formianu amonu 50mM (pH 5.5) przy szybkości przepływu 1mL/min. Wartość pH podano w [ ].
- Wszystkie próbki należy analizować w trzech powtórzeniach, jednak do dalszych analiz należy włączyć wartości tylko wtedy, gdy współczynnik zmienności jest mniejszy niż 10%.
4. Pomiar allantoiny metodą GC/MS
- Do 50 μl osocza odłożonego na potrzeby oznaczenia allantoiny podczas pobierania i przetwarzania próbek dodać 50 μl 10 μM DL-Allantoin-5-13C;1-15N (standard wewnętrzny).
- Do otrzymanego roztworu osocza dodać 100 μl acetonitrylu.
- Mieszaninę mieszać na wortexie przez 10-20 s, a następnie odwirować przy 4°C z prędkością 20 000 g przez 10 min.
- Zdjąć nadsącz, przelać go do fiolki GC/MS i wysuszyć pod strumieniem N2.
- Po wysuszeniu dodać 50 μl czynnika pochodzującego N-tert-butylodymetylsylo- N-metylotrifluoroacetamidu (MTBSTFA) w pirydynie (1:1 obj./obj.), zamknąć fiolki i inkubować w temperaturze 50°C przez 2 h. Deriwatyzacja ta pozwala na uzyskanie powtarzalnych, mierzalnych pików m/z 398,0 oraz 400,0 odpowiednio dla allantoiny i DL-allantoin-5-13C;1-15N20.
- Próbki analizować za pomocą urządzeń Agilent Technologies GC 6890N oraz MS 5973 wyposażonych w autosampler. Rozdział związków przeprowadzić na kolumnie kapilarnej Agilent 122-5532G (długość 25,7 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm). Jako gaz nośny zastosować hel z przepływem 1,5 ml/min. Wstrzyknąć produkt deriwatyzacji (1 μl) w trybie split (stosunek podziału 20:1, przepływ split 29,4 ml/min, przepływ całkowity 33,8 ml/min). Początkową temperaturę kolumny ustawić na 100°C i utrzymać przez 2 min, a następnie zwiększyć do 180°C z szybkością 10°C/min. Temperaturę tę utrzymać przez 4 min, a następnie zwiększyć do 260°C z szybkością 20°C/min. Temperaturę tę utrzymać do końca analizy. Po każdej próbce oczyścić kolumnę, wykonując 2 wtryski heksanu.
- Ilość allantoiny oznaczyć w trybie monitorowania wybranych jonów (SIM), monitorując jon m/z 398,0 dla allantoiny oraz jon m/z 400,0 dla DL-allantoin-5-13C;1-15N. Stosunki obfitości jonów allantoiny/(ciężka allantoina) przeliczyć na stężenia mikromolarne allantoiny, korzystając z przygotowanej krzywej wzorcowej.
- Wszystkie próbki analizować w trzech powtórzeniach, jednak w dalszych analizach wykorzystać tylko wartości z współczynnikiem zmienności poniżej 10%.
5. Przygotowanie standardu wewnętrznego, metylomalondialdehydu (MMDA), do analizy MDA
- Do kolby okrągłodnej o pojemności 100ml dodać 523μl 3-etoksymetakroleiny do 1477μl 7M NaOH. Włożyć mieszadło magnetyczne.
- Umieścić kolbę w kąpieli wodnej o temperaturze 45°C i mieszać do zakończenia reakcji. Powinno to zająć około 140 min. Postęp reakcji monitorować poprzez okresowe pobieranie 10μl aliquoty cieczy w odstępach 10 min. Każdą pobraną próbkę rozcieńczyć 105 razy w 50 mM buforze fosforanowym potasu (pH 7) i zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Reakcja jest zakończona, gdy absorbancja przy 275nm osiągnie wartość około 0,658. W miarę postępu reakcji roztwór zmieni kolor na żółty, a następnie pomarańczowy.
- Pozostawić reakcję na dodatkowe 15 min.
- Do kolby okrągłodnej dodać 5ml destylowanej wody dejonizowanej i przenieść roztwór do rozdzielacza. Użyć dodatkowych 3 ml wody, aby wypłukać zawartość kolby do rozdzielacza. Do rozdzielacza dodać kolejne 2ml wody.
- Ekstrahować roztwór 3 razy za pomocą 5 ml dichlorometanu. Po każdej ekstrakcji odrzucić warstwę organiczną.
- Po trzeciej ekstrakcji przenieść warstwę wodną do kolby okrągłodnej i odparować do sucha za pomocą rotavapa.
- Produkt zawiesić ponownie w 3ml etanolu i przenieść do zważonej wcześniej probówki stożkowej o pojemności 15ml. Wypłukać kolbę dodatkowymi 2ml etanolu i dodać płuczkę do probówki stożkowej.
- Dodać 5ml benzenu i inkubować probówkę w ciepłej wodzie do czasu rozpuszczenia produktu, a następnie niezwłocznie umieścić probówkę w lodzie na 10 min. Wirować przez 5 min przy 15000 g i usunąć nadsącz.
- Do osadu dodać 5ml etanolu i 5 ml eteru izopropylowego. Rozpuścić osad, inkubując probówkę w ciepłej wodzie i okresowo, bardzo delikatnie przechylając probówkę. Po rozpuszczeniu osadu umieścić probówkę w lodzie na 10 min. Przeprowadzić tę rekrystalizację jeszcze 2 razy z użyciem etanolu i eteru izopropylowego. Mogą powstać nierozpuszczalne białe grudki produktu.
- Po ostatnim etapie rekrystalizacji usunąć jak najwięcej nadsączu i wysuszyć otrzymany produkt w Speedvacu. Zważyć probówkę stożkową z syntetyzowanym produktem.
- Do probówki dodać 5ml wody, wymieszać na vortexie i odfiltrować wszelkie pozostałe ciała stałe.
- Użyć spektrofotometru UV-Vis w celu określenia końcowego stężenia MMDA. λmax dla MMDA w 50 mM buforze fosforanowym potasu (pH 7) wynosi 274 nm przy współczynniku ekstynkcji 29900 M-1cm-1 14.
6. Pomiar MDA metodą GC/MS
- Przygotować roztwór 0,5mM butylohydroksytoluenu (BTH) w etanolu, dodając 0,11 g BTH do 9 ml etanolu i uzupełniając końcową objętość do 10 ml. Następnie wykonać rozcieńczenie, dodając 10 μl tego stężonego roztworu do 990 μl etanolu.
- Przygotować roztwór 50mM fenylohydrazyny, dodając 4,92 μl fenylohydrazyny do 995 μl wody w ciemnej probówce do mikrowirówki. Wymieszać roztwór za pomocą wortexa.
- Dodać 5 μl 10 μM MMDA do 100 μl osocza odstawionego do analizy MDA podczas pobierania i przetwarzania próbek.
- Następnie dodać 10 μl 0,5mM BTH do mieszaniny MMDA/osocze, a następnie dodać 200 μl 1M cytrynianu sodu o pH 4. Wartość pH ta jest kluczowa dla prawidłowej derywatyzacji próbki. Wyższe lub niższe pH spowoduje zafałszowanie poziomu MDA.
- Rozcieńczyć końcową mieszaninę, dodając destylowaną wodę dejonizowaną do końcowej objętości 480 μl.
- Przeprowadzić derywatyzację roztworu, dodając 20 μl 50mM fenylohydrazyny, zamknąć fiolki i inkubować roztwór w temperaturze 25°C przez 30 min na wytrząsarce orbitalnej.
- Dodać 1 ml heksanu, mieszać wortexem przez 1 min i wirować przy 3000 rpm przez 10 min.
- Przenieść warstwę organiczną do fiolki do GC/MS i zagęścić roztwór do 100 μl strumieniem N2.
- Przeanalizować próbki na urządzeniu GC/MS przy użyciu autosamplera. Rozdzielenie związków przeprowadzić na kolumnie kapilarnej Agilent 122-5532G (długość 25,7 m, średnica wewnętrzna 0,25 mm). Jako gaz nośny zastosować hel z przepływem 0,6-0,8 ml/min. Wtrysnąć produkt derywatyzowany (2 μl) w trybie split (stosunek podziału 20:1, przepływ split 23,0 ml/min, przepływ całkowity 27,1 ml/min). Początkową temperaturę kolumny ustawić na 110°C i utrzymać ją przez 1 min, a następnie zwiększyć do 250°C z szybkością 40°C/min. Utrzymywać tę temperaturę do końca analizy. Po każdej próbce oczyścić kolumnę za pomocą 2 wtrysków heksanu.
- Ilościowo oznaczyć MDA w trybie monitorowania wybranych jonów (SIM), używając m/z 144,00 dla MDA oraz m/z 158,00 dla MMDA. Przeliczyć stosunki obfitości jonów MDA/MMDA na stężenia mikromolarne przy użyciu krzywej wzorcowej.
- Próbki analizować w trzech powtórzeniach i wykorzystywać wyłącznie wartości o współczynniku zmienności poniżej 10%.
7. Pomiar ksantynooksydazy metodą HPLC
- Wykrywanie aktywności oksydazy ksantynowej zależy od możliwości czułego pomiaru poziomu odpowiedniego substratu (pteryny) oraz produktu (izoksantopteryny). Osocze inkubuje się z substratem przez 0 min (kontrola) lub 4 h, a następnie określa zależną od inkubacji konwersję substratu w produkt.
- Do każdej probówki (0 i 4 h) dodać 240μl buforu Tris-HCl 0,2 M (pH 9,0) oraz 4,63μl pteryny 7,083x10-3 M i preinkubować w temperaturze 37°C przez 5 min.
- Reakcję enzymatyczną rozpocząć poprzez dodanie 60μl osocza do każdej probówki.
- Do probówki kontrolnej (0 min) natychmiast dodać 300μl 4% HClO4, natomiast pozostałą mieszaninę inkubować przez 4 godziny przed zatrzymaniem reakcji za pomocą 300μl 4% HClO4.
- Po dodaniu HClO4 energicznie wstrząsnąć probówką, a następnie odwirować w temperaturze 4°C przy 15000 g przez 15 min.
- Odebrać 500μl supernatantu i zneutralizować, dodając 20μl 5M K2CO3. Energicznie wstrząsnąć probówką, a następnie odwirować w temperaturze 4°C przy 15000 g przez 15 min.
- Dodać 350μl zneutralizowanego roztworu do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1x10-8 mol 2-AP.
- Próbki analizować za pomocą HPLC wyposażonego w skanujący detektor fluorescencyjny. Dla każdej próbki wykonuje się trzy iniekcje po 50 μl. Próbki wstrzykiwać na kolumnę Wacosil 5C-18-200 250 mm x 6,0 mm, 5 μm wyposażoną w strażnik kolumny Supelguard LC-18-S. W celu uzyskania odpowiedniej separacji i identyfikacji pików należy zastosować następujące warunki izokratyczne: 95% buforu KPO4 20mM (pH 2,2) i 5% metanolu przy przepływie 1ml/min. Długość fali wzbudzenia detektora fluorescencyjnego ustawić na 345 nm, a długość fali emisji na 410 nm.
- Wyznaczyć stosunki pteryny i izoksantopteryny do 2-AP, obliczając pola powierzchni pików ze spektru detektora fluorescencyjnego. Pierwszy pik w widmie, w ok. 5 minucie, odpowiada 2-AP. Drugi i największy pik będzie należał do pteryny. Pik izoksantopteryny eluje jako ostatni.
- Obliczyć różnicę w stosunkach pól powierzchni piku izoksantopteryny/2-AP pomiędzy punktami czasowymi inkubacji 0 i 4 h. Wartość tę wykorzystać do obliczenia aktywności XO na podstawie krzywych wzorcowych.
- Próbki analizować w trzech powtórzeniach, przyjmując do dalszych obliczeń tylko wartości z współczynnikiem zmienności poniżej 10%.
8. Reprezentatywne wyniki:
Przykład ilościowego oznaczenia związków purynowych metodą HPLC przedstawiono na Rysunku 1A. Specyficzne czasy retencji i długości fal emisji hypoksantyny, ksantyny oraz kwasu moczowego umożliwiają jednoczesne oznaczenie ilościowe związków purynowych (Tabela 2). Przy prawidłowym przebiegu analizy związki te wykazują odpowiednią separację, a kształt piku jest ostry i jednomodalny. Piki te są następnie przeliczane na stężenia (zakresy podano w Tabeli 3) przy użyciu krzywych wzorcowych. Ponieważ przygotowanie próbek do tej analizy jest minimalne, jedynym problemem związanym z próbką może być hemoliza erytrocytów. Jeśli erytrocyty ulegną lizie przed odwirowaniem próbek, osocze przybierze kolor pomarańczowo-czerwony i nie będzie nadawało się do oceny niedokrwienia hipoksycznego. Pozostałe problemy, które mogą wystąpić podczas pomiaru puryn, dotyczą systemu HPLC oraz kolumny (Rysunek 1B). W przypadku obecności pęcherzyków powietrza w systemie HPLC czasy retencji ulegną przesunięciu, a ciśnienie HPLC będzie gwałtownie wahać się. Jeśli wkład strażniczy wymaga wymiany, ciśnienie wzrośnie, a piki ulegną poszerzeniu i staną się bi- lub trimodalne.
| Hypoksantyna (μM) | Ksantyna (μM) | Kwas moczowy (μM) | Ksantynoooksydaza ((nmol produktu)/min) | Malondialdehyd (μM) | Alantoina (μM) | |
| Termin normoksyczny | 1.13-19.3 (64) | 0.02-3.69 (61) | 107.20-726.12 (63) | 2.47x10-6 - 3.92x10-3 (20) | 0.44-3.76 (53) | NA |
| Termin z zespołem niewydolności oddechowej | 1.78-12.59 (27) | 0.07-11.8 (24) | 225.40-653.32 (27) | 0 - 1.03x10-5 (8) | 0.82-2.73 (24) | NA |
| Termin hipoksyczny | 0.38-31.80 (13) | 0.11-2.88 (13) | 235.65-1348.13 (13) | 1.20x10-5 -236.44 (9) | 0.95-2.15 (7) | NA |
| Przedwczesny normoksyczny | 1.54-4.39 (9) | 0.03-1.77 (9) | 178.92-593.49 (9) | 2.46x10-5 - 5.44x10-4 (2) | 0.95-2.74 (8) | 2.30-5.26 (67) |
| Przedwczesny z zespołem niewydolności oddechowej | 3.04-8.04 (2) | NA | 327.56-365.11 (2) | NA | 2.40-3.46 (3) | NA |
Min-Max (n)
Tabela 3. Reprezentatywne zakresy dla puryn, oksydazy ksantynowej, malodialdehydu i allantoiny.
Przykład ilościowego oznaczenia alantoiny metodą GC/MS przedstawiono na Rysunku 2. Ponieważ masa zderatyzowanej alantoiny oraz zderatyzowanej alantoiny ciężkiej jest znana, do identyfikacji tych związków w spektrometrze mas można zastosować tryb wyboru jonów. Jeśli badanie zostanie przeprowadzone prawidłowo, w tym samym czasie retencji zaobserwowane zostaną dwa piki. Jeden odpowiadający alantoinie (398,00 m/z), a drugi alantoinie ciężkiej (400,00 m/z). Piki te są następnie przeliczane na stężenia (zakresy przedstawione w Tabeli 3) przy użyciu krzywej wzorcowej. Jeśli badanie zostanie przeprowadzone nieprawidłowo i próbki nie zostaną poddane właściwej derywatyzacji, piki mogą być nieobecne lub nie reprezentować ilościowo zawartości związku. Ponownie zaznacza się, że w przypadku lizy erytrocytów plazma nie może być wykorzystana do oceny stresu oksydacyjnego w młodzieńczym niedotlenieniu niedokrwiennym).
Wyniki ilościowego oznaczenia MDA są podobne do wyników dla alantoiny, z wyjątkiem tego, że dwa piki są obserwowane przy różnych czasach retencji. Przy czasie retencji ~ 3,5 minuty obserwuje się pik 144,00 m/z dla MDA, a przy czasie retencji ~ 4 minuty pik 158,00 m/z dla MMDA (Rycina 3). Piki te są następnie przeliczane na stężenia (zakresy przedstawione w Tabeli 3) przy użyciu krzywej wzorcowej. Jeśli analiza zostanie przeprowadzona nieprawidłowo lub próbki nie zostaną odpowiednio zderywatyzowane, przy wyborze 144,00m/z i 158,00m/z może nie być obserwowanych żadnych pików. Należy zauważyć, że w przypadku nadmiaru lipidów w osoczu po dawkach bolusowych w żywieniu doustnym lub dożylnej podaży lipidów, osocze przybierze mleczny wygląd i nie będzie mogło zostać użyte do oceny stresu oksydacyjnego w niedotlenieniowo- niedokrwiennej encefalopatii noworodków.
Przykład ilościowego oznaczenia aktywności oksydazy ksantynowej metodą HPLC przedstawiono na Rysunku 4. Jeśli badanie zostanie przeprowadzone prawidłowo, detektor fluorescencyjny powinien wykryć trzy piki: jeden dla pteryny, jeden dla izoksantopteryny oraz jeden dla 2-AP. Piki te są następnie przeliczane na stężenia (zakresy podano w Tabeli 3) przy użyciu krzywej wzorcowej. W widmie generowanym przez detektor PDA powinien również pojawić się pik odpowiadający izoksantopterynie i 2-AP. W przypadku braku aktywności enzymatycznej nie będzie widoczny pik odpowiadający izoksantopterynie. Ponieważ badanie to mierzy funkcję enzymu, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie próbki może wpłynąć na uzyskane wyniki.
Rycina 1. Widmo HPLC dla identyfikacji związków purynowych. A). Reprezentatywne wyniki w przypadku prawidłowego przeprowadzenia analizy. B). Reprezentatywne wyniki w przypadku wystąpienia problemu z urządzeniem HPLC, kolumną lub wkładem ochronnym.
Rysunek 2. Widmo GC/MS dla oznaczania ilościowego alantoiny. Pik dla jonu 398,00 m/z odpowiada alantoinie. Pik dla jonu 400,00 m/z odpowiada ciężkiej alantoinie.
Rysunek 3. Widmo GC/MS dla oznaczania ilościowego MDA. Pik przy jonie 144,00 m/z odpowiada MDA. Pik przy jonie 158,00 m/z odpowiada MMDA.
Rysunek 4. Spektrum HPLC dla pomiaru aktywności XO. A) Reprezentatywne wyniki dla czasu inkubacji 0 min oraz B) reprezentatywne wyniki dla czasu inkubacji 4 h. Zwróć uwagę na wyższy pik izoksantopteryny (w ~17 min) dla czasu inkubacji 4 h. W spektrum fluorescencji 2-AP eluiuje jako pierwszy w ~5 min, a pteryna eluiuje następnie w ~10 min.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj metody pozwalają na ocenę noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia. Protokół ten łączy pomiary markerów deficytu energii (ATP), stresu oksydacyjnego, uszkodzeń oksydacyjnych oraz aktywności enzymatycznej, aby uzyskać ogólny obraz biochemiczny obecności, a nawet stopnia niedotlenienia i niedokrwienia. Pomimo użyteczności tej metody, istnieją pewne potencjalne ograniczenia. Po pierwsze, do pobrania wystarczającej ilości osocza w celu przeprowadzenia wszystkich analiz potrzeba około 1-2 ml krwi. Nie będzie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca jest finansowana przez National Institutes of Health w ramach grantu R01 NR011209-03
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka 6ml K3E EDTA K3 | Fisher Scientific | 2204061 | |
| Wirówka 5702R | Fisher Scientific | 05413319 | Z adapterem 13&16MM |
| Probówka do mikrowirówki 1.5ml | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopuryna | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Spektrofotometr Varian Cary 100 | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Centryfugacyjny filtr Micron | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Kolumna Supelcosil LC-18-S | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Wkład i uchwyt Supelguard Supelcosil LC-18-S | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| Fiolka do GCMS | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Partia #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pirydyna | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Nr części dla 5975E GC/MS |
| 3-Etoksymetakroleina | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichlorometan | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzen | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Eter diizopropylowy | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fenylohydrazyna | Sigma-Aldrich | P26252 |
Bibliografia
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
