Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Podsumowanie

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Streszczenie

Rozwój precyzyjnego obwodu węchowego opiera się na dokładnej projekcji aksonów neuronów sensorycznych węchu (OSN) do ich celów synaptycznych w opuszce węchowej (OB). Molekularne mechanizmy wzrostu i ukierunkowania aksonów OSN nie są dobrze poznane. Manipulowanie ekspresją genów i późniejsza wizualizacja pojedynczych aksonów OSN oraz morfologii ich drzewa terminalnego stanowiły dotychczas wyzwanie. Aby badać funkcję genów na poziomie pojedynczej komórki w określonym przedziale czasowym, opracowaliśmy technikę opartą na lentiwirusach do manipulowania ekspresją genów w OSN in vivo. Cząstki lentiwirusowe są dostarczane do OSN poprzez mikroiniekcję do nabłonka węchowego (OE). Kasety ekspresyjne są następnie trwale integrowane z genomem transdukowanych OSN. Ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego pozwala na identyfikację zainfekowanych OSN i zarysowanie ich pełnej morfologii, w tym drzewa terminalnego aksonu. Dzięki krótkiemu czasowi oczekiwania między mikroiniekcją a detekcją reportera, badania nad funkcją genów mogą być skoncentrowane na bardzo wąskim okresie rozwoju. Przy użyciu tej metody wykryliśmy ekspresję GFP już po trzech dniach, a także po trzech miesiącach od iniekcji. Za pomocą lentiwirusowej mikroiniekcji osiągnęliśmy zarówno nadekspresję, jak i wyciszenie za pomocą shRNA. Metoda ta umożliwia uzyskanie szczegółowej morfologii ciał komórkowych i aksonów OSN na poziomie pojedynczej komórki in vivo, a tym samym pozwala na charakterystykę funkcji genów kandydackich podczas rozwoju węchu.

Protokół

1. Przygotowanie

Procedura ta jest przeprowadzana w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, dlatego wszystkie poniższe przygotowania są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza do pracy z materiałem biologicznym, w której odbywa się procedura mikroiniekcji.

1. Przygotować i rozgrzać łaźnię wodną o temperaturze 37°C: wypełnić plastikowy worek do przechowywania wodą – zamknąć go i umieścić na pustym inkubatorze blokowym. Umożliwi to myszom rekonwalescencję po iniekcji.
2. Wypełnić pojemnik na odpady biologiczne 10% roztworem wybielacza w objętości odpowiedniej do zanurzenia wszystkich odpadów powstałych podczas tej procedury.
3. Przygotować małe otwarte naczynie z 70% etanolem oraz drugie naczynie ze sterylną wodą ddH2O i umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
4. Zsterylizować strzykawkę Hamiltona o pojemności 5μL z igłą o rozmiarze 33G, spryskując korpus i igłę 70% etanolem przy całkowicie wysuniętym tłoku. Wielokrotnie aspirując etanol z naczynia i całkowicie go wypychając, powtórzyć czynność co najmniej 5 razy.
5. Przepłukać wkład strzykawki, aspirując i wypychając sterylną wodę co najmniej 5 razy. Odłożyć strzykawkę w bezpieczne miejsce w dygestorium i pozostawić do wyschnięcia.
6. Wyjąć zapasy wirusa z zamrażarki -80°C i umieścić na lodzie w celu rozmrożenia. Do mikroiniekcji wymagane są 2μL zapasu wirusa na mysz przy mianie 10⁹ jednostek zakaźnych/mL. Lentiwirusy można pozyskać z komercyjnych źródeł lub wyprodukować w laboratorium zgodnie z ustalonym protokołem (Lois et al., 2002).
7. Przygotować platformę do iniekcji, która zapewni obszar podniesiony ponad powierzchnię dygestorium – można wykorzystać 10cm szalkę hodowlaną przykrytą arkuszem chusteczki Kimwipe.
8. Umieścić chusteczki nasączone alkoholem w pobliżu stanowiska do iniekcji.

2. Mikroiniekcja cząsteczek lentiwirusowych do nabłonka węchowego

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzone w tej metodzie zostały wykonane zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez IACUC. Modelem zwierzęcym wykorzystanym we wszystkich zaprezentowanych tutaj eksperymentach jest szczep C57BL/6J myszy Mus musculus.

1. Znieczul młode myszy poprzez hipotermię, wyjmując szczenię (P0-P3) z klatki i kładąc je na rozciętej rękawiczce na lodzie na 5 minut.
2. Oczekując na pełne znieczulenie szczenięcia, pobierz 2μL zapasu wirusa do wysterylizowanej strzykawki Hamiltona.
3. Umieść młodą mysz na platformie do iniekcji. Delikatnie odciągnij skórę od czubka głowy w okolicy ucha w stronę karku. Powinno to napiąć skórę nad jamą nosową, co ułatwi iniekcję.
4. Wprowadź igłę przez górną część jamy nosowej około 3mm poniżej powierzchni skóry, aby dotrzeć do nabłonka węchowego. Wykonaj mikroiniekcję 0,5μL roztworu wirusa na jeden wstrzyk, wybierając dwa miejsca na każdą stronę, lewą i prawą (łącznie cztery iniekcje na mysz = wymagane 2μL wirusa). Miejsca iniekcji powinny być rozmieszczone w odstępach od siebie. Aby precyzyjnie wyznaczyć miejsca wstrzykiwania, zlokalizuj na grzbietowej powierzchni czaszki obrys opuszki węchowej. Linia ta jest ledwo widoczna po urodzeniu przez półprzezroczystą skórę i czaszkę. Aby wykonać dwie iniekcje na stronę, skieruj pierwszą iniekcję tuż rostralnie od obrysu opuszki na osi przyśrodkowej. Drugie wkłucie wykonaj bocznie względem obrysu opuszki, jednak skieruj igłę przyśrodkowo, aby dotrzeć do nabłonka węchowego znajdującego się brzusznie pod opuszką. Unikaj przebicia opuszki węchowej!
5. Osusz za pomocą chusteczki Kimwipe wszelkie pozostałości roztworu wirusa lub krwi, które mogą wypłynąć z miejsca iniekcji lub otworów nozdrzy. Zużyte chusteczki Kimwipe natychmiast wyrzuć do pojemnika na odpady biologiczne z rozcieńczonym wybielaczem.
6. Umieść zainfekowaną mysz w inkubatorze z wodnym podłożem.
7. Powtórz kroki 1-4 dla wszystkich myszy przeznaczonych do iniekcji, pamiętając, że na każdą mysz będziesz potrzebować około 2μL zapasu wirusa.
8. Pozostaw myszy w inkubatorze z wodnym podłożem na 30 minut w celu rekonwalescencji przed powrotem do oryginalnej klatki gniazdowej.
9. Platformę do mikroiniekcji, chusteczki dezynfekujące oraz wszelkie dodatkowe papierowe produkty do czyszczenia wyrzuć do utylizacji odpadów biologicznych z wybielaczem.
10. Oczyść strzykawkę Hamiltona poprzez wielokrotne zasysanie i wyrzucanie etanolu, a następnie wody, zgodnie z procedurą przygotowania. Pozostaw strzykawkę do wyschnięcia.
11. Aby uzyskać maksymalną wydajność transdukcji, powtórz tę procedurę za 4 godziny. Zainfekowane OSN można wizualizować na całej długości komórki już po trzech dniach.

3. Immunohistochemia w wolnopływających przekrojach opuszki węchowej

1. Uśmierć wstrzykniętą mysz w wybranym punkcie czasowym i utrwal tkankę poprzez perfuzję 4% paraformaldehydem. Wypreparuj opuszki węchowe (OB). Inkubuj w paraformaldehydzie przez noc, a następnie w 30% sacharozie w PBS przez noc. Osadź w medium do zatapiania O.C.T. na suchym lodzie.
2. Przekroje czołowe OB o grubości 60μm wykonaj przy użyciu kriotomu. Przenieś przekroje do 10cm szalki hodowlanej zawierającej 5mL 1x PBS (pH 7.4). Przekroje powinny swobodnie pływać w PBS, aby umożliwić rozpuszczenie O.C.T. Przenieś pływające przekroje wraz z PBS do 50mL probówki stożkowej.
3. Pozostaw przekroje do opadnięcia na dno probówki. Odsącz PBS za pomocą odessania (vacuum), uważając, aby nie wciągnąć przekrojów. Przepłucz przekroje tkankowe 20mL PBS. Powtórz kroki osadzania i odsysania. Resuspenduj tkankę w 10mL PBS i przenieś pływające przekroje do 15mL probówki stożkowej w celu przeprowadzenia immunobarwienia. Po opadnięciu przekrojów tkankowych odessij nadsącz PBS, nie naruszając tkanki. Resuspenduj przekroje w 0,3% Triton X-100 w 1x PBS, pH 7.4 (PBS-Tx), aby detergent mógł perforować błony komórkowe. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessij nadsącz i powtórz inkubację z PBS-Tx dwukrotnie.
4. Inkubuj przekroje tkankowe w 10mL roztworu blokującego (5% surowicy konia w PBS-Tx) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.
5. Przepłucz roztwór blokujący co najmniej dwukrotnie w PBS-Tx po 15 minut każdy w temperaturze pokojowej.
6. Przygotuj 2mL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w PBS-Tx. Listę przeciwciał użytych w tym eksperymencie znajduje się w sekcji Odczynniki i sprzęt.
7. Zastąp drugie płukanie blokujące w PBS-Tx roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubuj na powolnej platformie kołyszącej (~30rpm) w temperaturze 4°C przez 24-48 godzin, aby zapewnić całkowitą penetrację do 60μm pływających przekrojów.
8. Po inkubacji roztwór przeciwciała pierwszorzędowego można ostrożnie odzyskać za pomocą pipety i przechowywać w temperaturze 4°C w celu ponownego użycia do dwóch kolejnych razy w ciągu dwóch tygodni, bez znaczącej utraty intensywności barwienia.
9. Przemyj przekroje trzykrotnie w PBS-Tx po 20 minut każdy w temperaturze pokojowej przy łagodnej rotacji (~30rpm).
10. Przygotuj 2mL rozcieńczenia przeciwciała wtórnego w PBS-Tx. Odessij ostatni roztwór płuczący i dodaj roztwór przeciwciała wtórnego do przekrojów tkankowych. Owiń zewnętrzną stronę probówki do barwienia folią aluminiową, aby zablokować światło, które może powodować fotobielenie fluoroforów. Umieść owiniętą probówkę na powolnej platformie kołyszącej i inkubuj w temperaturze 4°C przez noc.
11. Usuń roztwór przeciwciała wtórnego poprzez odsysanie. Przemyj przekroje raz w PBS-Tx przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz dodatkowo dwa razy w PBS (pH 7.4) po 20 minut każdy w temperaturze pokojowej. Zamocuj zabarwione przekroje tkankowe na szkiełkach przedmiotowych, używając Fluoromount G.
12. Przeskanuj zabarwione przekroje w poszukiwaniu zainfekowanych dodatnio aksonów OSN i zakończeń aksonalnych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
13. Aby stworzyć trójwymiarowy widok oznakowanego aksonu OSN i drzewa terminalnego, wykonaj serię przekrojów optycznych przez 60μm głębokości docelowego plasterka tkanki OB (wzdłuż osi z) przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
14. Ten stos obrazów z przekrojów Z może zostać następnie wspólnie rzutowany w celu zrekonstruowania perspektywy obrotowej 360° pojedynczego oznakowanego aksonu OSN, w tym pełnych szczegółów drzewa terminalnego. Dowolny pojedynczy kąt obrotu może zostać przechwycony i wyeksportowany jako plik obrazu (np. JPG, TIFF) do prezentacji w formacie 2D.

4. Reprezentatywne wyniki

Stosując opisane tutaj metody, możemy transdukować neurony sensoryczne węchu za pomocą lentiwirusa in vivo. Do tej pory wizualizowaliśmy zainfekowane OSN za pomocą reporterów fluorescencyjnych GFP i mCherry, a także białka fuzyjnego z tagiem myc poprzez immunocytochemię. Technika ta zapewnia dużą liczbę zainfekowanych OSN. Jednocześnie transdukcja zachodzi na tyle sporadycznie, że pozwala na uzyskanie pojedynczo znakowanych OSN, co umożliwia analizę morfologii pojedynczych komórek. Aksony i zakończenia aksonalne są obrazowane w przekrojach tkanki OB w ich naturalnym środowisku za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rycina 1). Całe drzewo zakończeń aksonalnych OSN można zazwyczaj uchwycić w obrębie przekroju optycznego o grubości 40-50μm. Duże powiększenie zakończeń aksonalnych zainfekowanych OSN pozwala na szczegółową analizę morfologii drzewa aksonalnego w warstwie kłębkowej.

Rysunek 1. Trajektoria aksonu pojedynczego neuronu sensorycznego węchu i jego rozgałęzienie końcowe. A) Przekrój czołowy opuszki węchowej myszy P7 wykazujący warstwę nerwu węchowego (ONL) immunobarwioną na OMP (czerwony) oraz warstwę kłębową (GL) immunobarwioną zarówno na OMP, jak i Vglut2 (szary). Pojedynczy akson neuronu sensorycznego węchu wykazujący ekspresję GFP (zielony) przebiega w obrębie ONL i wnika do struktury kłębka. B) Morfologia rozgałęzienia końcowego aksonu w obrębie kłębka wyraźnie zaznaczona ekspresją GFP. Współbarwienie Vglut2 w kolorze szarym oświetla całkowity obszar kłębka, w którym akson GFP-dodatni tworzy rozgałęzienie końcowe. C) Zainfekowane lentiwirusem neurony sensoryczne węchu (OSN) wykazujące ekspresję GFP (zielony) w nabłonku węchowym (OE). Cytostruktura nabłonka węchowego jest pokazana za pomocą barwienia DAPI (niebieski). Ekspresja GFP umożliwia wizualizację ciał komórkowych OSN oraz ich wypustek komórkowych w OE. D) Akson OSN i jego morfologia końcowa przy wyciszeniu ekspresji Rap1GAP2 za pomocą shRNA. Do OE podano lentiwirusy niosące podwójną kasetę ekspresyjną z shRNA Rap1GAP2 pod promotorem mysim U6 oraz GFP pod promotorem CMV. Zainfekowane zakończenia aksonów węchowych wykazywały bardziej uproszczone rozgałęzienie końcowe w porównaniu do kontroli z samym GFP. Pasek skali = 20μm.

Dyskusja

Mikroiniekcja lentiwirusa skutkuje trwałą integracją konstruktów genowych z DNA genomicznym OSN. Podejście to pozwala na krótko- lub długoterminowe manipulacje genami kandydackimi poprzez nadekspresję lub wyciszenie za pomocą shRNA. Ponadto możemy fluorescencyjnie znakować pojedyncze OSN w istniejącej linii myszy transgenicznych, aby obserwować kolokalizację populacji receptorów zapachowych. Mikroiniekcja jest niezbędna do transdukcji lentiwirusowej OSN. Podejmowaliśmy próby wprowadzania zawiesiny lentiwirusa do jamy nos...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroiniekcja: Noworodki myszy poddano mikroiniekcji przy użyciu 5μStrzykawka Hamilton L (Hamilton #7647-01) wyposażona w igłę o rozmiarze 33 G (Hamilton #7762-06). Odczynniki do immunocytochemii: Przeciwciała pierwszorzędowe: królicze przeciwciało poliklonalne przeciw GFP (Molecular Probes# A-6455), kurze przeciwciało poliklonalne przeciw OMP (zamówienie specjalne) (Chen et al., 2005), świni morskiej przeciwciało poliklonalne przeciw VGlut2 (Millipore# AB2251). Przeciwciała drugorzędowe: osiołkowe przeciwciało antykrólicze sprzężone z Cy2 (Jackson Immunolab# 711-225-152), osiołkowe przeciwciało antykurze sprzężone z Cy3 (Jackson Immunolab# 703-165-155) oraz kozie przeciwciało przeciw świni morskiej sprzężone z Cy5 (Jackson Immunolab# 106-175-008). Przetwory osadziono na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) z roztworem barwiącym chromatynę DAPI w stężeniu 50 ng/mL. Obrazowanie konfokalne: Obrazy serii Z (Z-stack) wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Olympus Flouview FV1000, a zgromadzone obrazy przetworzono w projekcje 3D z wykorzystaniem oprogramowania do akwizycji i analizy konfokalnej Olympus FV10-ASW 2.01.