Manipulacja genetyczna za pośrednictwem lentiwirusa i wizualizacja węchowych neuronów czuciowych in vivo

Podsumowanie

Prezentujemy technikę lentiwirusową do manipulacji genetycznej i wizualizacji aksonu pojedynczego węchowego neuronu czuciowego i jego końcowej arboryzacji in vivo.

Streszczenie

Rozwój precyzyjnego obwodu węchowego opiera się na dokładnym rzutowaniu aksonów węchowych neuronów czuciowych (OSN) na ich synaptykę w opuszce węchowej (OB). Mechanizmy molekularne wzrostu i celowania aksonów OSN nie są dobrze poznane. Manipulowanie ekspresją genów i późniejsze Wizualizacja pojedynczych aksonów OSN i ich końcowej morfologii trzpienia była do tej pory wyzwaniem. Badanie funkcji genów na poziomie pojedynczej komórki w określonym opracowaliśmy technikę opartą na lentiwirusach do manipulowania ekspresją genów w OSN in vivo. Cząsteczki lentiwirusowe są dostarczane do OSN za pomocą mikroiniekcji do nabłonka węchowego (OE). Kasety ekspresyjne są następnie na stałe integrowane z genomem transdukowanych OSN. Ekspresja białek zielonej fluorescencji identyfikuje zainfekowane OSN i przedstawia całą ich morfologię, w tym trzpień końcowy aksonu. Ze względu na krótki czas realizacji między mikroiniekcją a Wykrywanie reporterowe, badania funkcji genów mogą być skoncentrowane w bardzo wąskim okresie rozwoju. Za pomocą tej metody wykryliśmy wyrażenie GFP w ramach as zaledwie trzy dni i tak długo, jak trzy miesiące po wstrzyknięciu. Osiągnęliśmy zarówno nadekspresję, jak i knock-down za pośrednictwem shRNA za pomocą mikroiniekcji lentiwirusowej. Metoda ta zapewnia szczegółową morfologię ciał komórkowych i aksonów OSN na poziomie pojedynczej komórki in vivo, a tym samym umożliwia scharakteryzowanie funkcji genu kandydującego podczas rozwoju węchowego.

Protokół

1. Przygotowanie

Ta procedura to poziom bezpieczeństwa biologicznego 2, dlatego wszystkie poniższe preparaty są przygotowywane w kapturze zagrożenia biologicznego, gdzie przeprowadzana jest procedura mikroiniekcji.

1. Przygotuj i podgrzej łóżko wodne o temperaturze 37°C: Napełnij plastikową torbę do przechowywania wodą – zamknij i umieść na opróżnionym inkubatorze z blokiem grzewczym. Umożliwi to myszom powrót do zdrowia po wstrzyknięciu.
2. Napełnij pojemnik na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne 10% wybielaczem do odpowiedniej objętości, aby zanurzyć wszystkie odpady z tej procedury.
3. Przygotuj małe otwarte naczynie z 70% etanolem i drugie naczynie ze wysterylizowanym ddH2O i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
4. Wysterylizuj strzykawkę Hamilton o pojemności 5 μl za pomocą igły o rozmiarze 33, spryskując ciało i igłę 70% etanolem z całkowicie wyciągniętym tłokiem. Kilkakrotnie zasysaj etanol z naczynia i wyrzuć go do końca co najmniej 5 razy.
5. Przepłukać wkład strzykawki, zasysając i wyrzucając sterylną wodę co najmniej 5 razy. Umieścić strzykawkę bezpiecznie na boku w kapturze hodowlanym i pozostawić do wyschnięcia.
6. Usuń zapasy wirusów z zamrażarki w temperaturze -80°C i umieść na lodzie, aby umożliwić rozmrożenie. Mikroiniekcja wymaga 2 μl zapasu wirusa na mysz przy mianie^10-9 jednostek zakaźnych/ml. Lentiwirusy mogą być pozyskiwane ze źródeł komercyjnych lub produkowane w laboratorium zgodnie z ustalonym protokołem (Lois i wsp., 2002).
7. Przygotuj etap iniekcji, który zapewnia obszar uniesiony ponad powierzchnię okapu - można użyć 10 cm naczynia hodowlanego pokrytego arkuszem Kimwipe.
8. Chusteczki nasączone alkoholem należy rozmieścić w pobliżu stacji iniekcyjnej.

2. Mikroiniekcja cząsteczek lentiwirusa do nabłonka węchowego

Wszystkie procedury na zwierzętach wykonywane tą metodą są wykonywane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. Szczep Mus musculus C57BL/6J jest modelem zwierzęcym używanym we wszystkich zademonstrowanych tutaj eksperymentach.

1. Znieczulenie szczeniąt myszy przez hipotermię, wyjmując młode myszy (P0-P3) z klatki i kładąc szczenię na rozciętej rękawicy na lodzie na 5 minut.
2. Czekając, aż szczenię zostanie w pełni znieczulone, odessaj 2 μl materiału wirusowego do wysterylizowanej strzykawki Hamiltona.
3. Umieść szczeniak myszy na etapie wstrzyknięcia. Delikatnie odciągnij skórę od czubka głowy przy uchu w kierunku górnej części szyi. Powinno to zapewnić nauczoną powierzchnię skóry nad jamą nosową i ułatwić wstrzykiwanie.
4. Wbij igłę przez górną część jamy nosowej około 3 mm poniżej powierzchni skóry, aby dotrzeć do nabłonka węchowego. Mikrowstrzyknij 0,5 μl roztworu wirusa na zastrzyk, wybierając dwa miejsca z każdej strony, zarówno po lewej, jak i prawej stronie (łącznie cztery wstrzyknięcia na mysz = potrzebne 2 μl wirusa). Miejsca wstrzyknięć należy ustawić naprzemiennie względem siebie. W celu ukierunkowania na właściwe miejsca wstrzyknięć należy przeszukać grzbietową powierzchnię czaszki w celu odnalezienia konturu opuszki węchowej. Linia ta jest ledwo widoczna po urodzeniu przez półprzezroczystą skórę i czaszkę. Aby wykonać dwa wstrzyknięcia na stronę, należy skierować jedno wstrzyknięcie dokładnie rostralnie do jednego obrysu bańki w osi przyśrodkowej. Drugie wstrzyknięcie należy wykonać bocznie do obrysu bańki, jednak należy upewnić się, że wstrzyknięcie jest ustawione pod kątem przyśrodkowym, tak aby można było dotrzeć do nabłonka węchowego, który znajduje się brzusznie pod opuszką. Unikaj penetracji opuszki węchowej!
5. Osuszyć wszelkie resztki roztworu wirusa lub krwi, które mogą wydostać się z miejsca wstrzyknięcia lub otworów nozdrzy, za pomocą chusteczki Kimwipe. Chusteczki Kimwipes należy natychmiast wyrzucić do pojemnika z rozcieńczonym wybielaczem w płynie.
6. Umieść wstrzykniętą mysz w inkubatorze ze łóżkiem wodnym.
7. Powtórz kroki 1-4 dla wszystkich myszy, które mają zostać wstrzyknięte, pamiętając, że będziesz potrzebować około 2 μl zapasu wirusa na mysz.
8. Pozwól myszom dojść do siebie w inkubatorze z łóżkiem wodnym przez 30 minut, zanim wrócą do pierwotnej klatki lęgowej.
9. Etap mikroiniekcji, chusteczki odkażające i wszelkie dodatkowe produkty papierowe do czyszczenia należy usunąć do płynnego wybielacza, który stwarza zagrożenie biologiczne.
10. Oczyścić strzykawkę Hamiltona poprzez wielokrotne zasysanie i wyrzucanie etanolu, a następnie wody, tak jak w etapach przygotowania. Pozostawić strzykawkę do wyschnięcia.
11. Aby uzyskać maksymalną wydajność transdukcji, powtórz tę procedurę ponownie za 4 godziny. Zainfekowane OSN mogą być uwidocznione na całej długości komórki w ciągu zaledwie trzech dni.

3. Immunohistochemia pływających odcinków opuszki węchowej

1. Poświęć wstrzykniętą mysz w pożądanym punkcie czasowym i perfuzję utrwal tkankę za pomocą 4% paraformaldehydu. Wypreparuj OB. Inkubuj w paraformaldehydzie przez noc, a następnie 30% sacharozy w PBS przez noc. Zanurzyć w podłożu do zatapiania O.C.T. na suchym lodzie.
2. Koronalne przekroje OB uzyskuje się o grubości 60 μm za pomocą kriostatu. Zamiataj skrawki cebulki do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego z 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Skrawki powinny unosić się w PBS, aby umożliwić rozpuszczenie się OCT. Przenieś pływające sekcje i PBS do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml.
3. Pozwolić, aby skrawki opadły na dno fiolki. Odkurz PBS bez zasysania jakichkolwiek sekcji. Przepłucz skrawki tkanek 20 ml PBS. Powtórz kroki osadzania i odkurzania. Ponownie zawiesić tkankę za pomocą 10 ml PBS i przenieść pływające odcinki do stożkowej fiolki o pojemności 15 ml w celu barwienia immunologicznego. Gdy skrawki tkanki osiądą, odkurz supernatant PBS bez naruszania tkanki. Ponownie zawiesić sekcje 0,3% Triton X-100 w 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx), umożliwiając detergentowi perforację błon komórkowych. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odkurzyć supernatant i powtórzyć inkubację z PBS-Tx dwukrotnie.
4. Inkubować skrawki tkanek w 10 ml roztworu blokującego (5% surowicy końskiej w PBS-Tx) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.
5. Przepłukać roztwór blokujący co najmniej dwa razy PBS-Tx przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Przygotować 2 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych w PBS-Tx. Zobacz sekcję Odczynniki i sprzęt, aby zapoznać się z przeciwciałami użytymi w tym eksperymencie.
7. Zastąp drugie płukanie blokujące PBS-Tx roztworem przeciwciała pierwotnego. Inkubuj na wolno kołyszącej się platformie (~30 obr./min) w temperaturze 4°C przez 24-48 godzin, aby zapewnić dokładną penetrację sekcji pływających o grubości 60 μm.
8. Po inkubacji roztwór przeciwciała pierwotnego można ostrożnie pobrać za pomocą pipety i przechowywać w temperaturze 4°C do ponownego użycia do dwóch razy w ciągu dwóch tygodni bez znaczącej utraty intensywności barwienia.
9. Umyj sekcje trzy razy w PBS-Tx przez 20 minut każdy w temperaturze pokojowej z delikatnymi obrotami (~30 obr./min).
10. Przygotować 2 ml rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych w PBS-Tx. Odkurzyć ostatnie płukanie i dodać roztwór przeciwciał drugorzędowych do skrawków tkanki. Owiń zewnętrzną część fiolki barwiącej folią aluminiową, aby zablokować światło, co może spowodować fotowybielanie fluoroforem. Umieścić owiniętą fiolkę na wolno kołyszącej się platformie i inkubować w temperaturze 4°C przez noc.
11. Wyrzuć wtórny roztwór przeciwciała, odkurzając. Umyj sekcje raz za pomocą PBS-Tx przez 20 minut każda w temperaturze pokojowej. Płukać jeszcze dwa razy PBS (pH 7,4) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj wybarwione skrawki tkanek na szkiełkach za pomocą Fluoromount G.
12. Przesiewać wybarwione skrawki pod kątem dodatnio zainfekowanych aksonów OSN i końców aksonów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
13. Aby skonstruować trójwymiarowy widok oznakowanego aksonu OSN i trzpienia końcowego, wykonaj serię przekrojów optycznych przez głębokość 60 μm docelowego wycinka tkanki OB (wzdłuż osi z) za pomocą mikroskopii konfokalnej.
14. Ten stos obrazów o przekroju Z może być następnie rzutowany razem, aby zrekonstruować perspektywę obrotu o 360° pojedynczego oznaczonego aksonu OSN, w tym szczegółów trzpienia końcowego w całości. Każdy pojedynczy kąt obrotu można przechwycić i wyeksportować jako plik obrazu (i.e. JPG, TIFF) do prezentacji w formacie 2D.

4. Reprezentatywne wyniki

Dzięki opisanym tutaj metodom, możemy transdukować węchowe neurony czuciowe za pomocą lentiwirusa in vivo. Do tej pory wizualizowaliśmy zakażone OSN za pomocą fluorescencyjnych reporterów GFP i mCherry, a także za pomocą białka fuzyjnego znakowanego myc za pomocą immunocytochemii. Ta technika zapewnia obfitość zainfekowanych OSN-ów. Mimo to transdukcja zachodzi na tyle sporadycznie, że zapewnia indywidualnie znakowane OSN, co pozwala na analizę morfologii pojedynczej komórki. Aksony i zakończenia aksonów są obrazowane w skrawkach tkanek OB w ich naturalnym środowisku za pomocą mikroskopii konfokalnej (ryc. 1). Cała trzpień końcowa aksonu OSN może być zwykle ujęty w przekroju optycznym 40-50 μm. Duże powiększenie zainfekowanych końców aksonów OSN pozwala na szczegółową analizę morfologii trzpienia aksonalnego w warstwie kłębuszkowej

Rysunek 1. Trajektoria aksonu pojedynczego węchowego neuronu czuciowego i jego końcowej altany. A) Przekrój koronalny opuszki węchowej myszy P7 pokazujący warstwę nerwu węchowego (ONL) wybarwioną immunologicznie na OMP (czerwony) i warstwę kłębuszkową (GL) wybarwioną immunologicznie zarówno OMP, jak i Vglut2 (szary). Pojedynczy akson węchowego neuronu czuciowego wyrażający GFP (zielony) przemieszcza się w obrębie ONL i wnika w strukturę kłębuszkową. B) Morfologia trzpienia końcowego aksonu w obrębie kłębuszków nerkowych wyraźnie uwydatniona przez ekspresję GFP. Współbarwienie Vglut2 na szaro oświetla całkowity obszar kłębuszka, w którym akson GFP-dodatni tworzy końcowy abor. C) Wirusowe OSN zakażone lentiwirusem wykazujące ekspresję GFP (zielony) w OE. Cytostruktura nabłonka węchowego jest pokazana za pomocą barwienia DAPI (niebieskiego). Ekspresja GFP umożliwia wizualizację ciał komórkowych OSN i ich procesów komórkowych w OE. D) Akson OSN i jego końcowa morfologia z powaleniem ekspresji Rap1GAP2 przez shRNA. Lentiwirusy przenoszące kasetę o podwójnej ekspresji z shRNA Rap1GAP2 pod mysim promotorem U6 i GFP pod promotorem CMV zastosowano do OE. Zainfekowane zakończenia aksonów węchowych wykazywały bardziej uproszczoną altanę końcową w porównaniu z kontrolą tylko GFP. Bar = 20μm.

Dyskusja

Mikroiniekcja lentiwirusa powoduje trwałe przeniesienie konstruktów genów do genomowego DNA OSN. Takie podejście pozwala nam na przeprowadzanie krótko- lub długoterminowych manipulacji genami kandydującymi poprzez nadekspresję lub knock-down za pośrednictwem shRNA. Ponadto możemy znakować fluorescencyjnie pojedyncze OSN w istniejącej linii myszy transgenicznych, aby zaobserwować kolokalizację populacji receptorów zapachowych. Mikroiniekcja jest wymagana do transdukcji lentiwirusowej OSN. Próbowaliśmy wypłukać zawiesinę l...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroiniekcja: Nowonarodzonym myszom wstrzyknięto mikroiniekcję za pomocą 5μ L Strzykawka Hamilton (Hamilton #7647-01) wyposażona w igłę o rozmiarze 33 (Hamilton #7762-06). Odczynniki immunocytochemiczne: Przeciwciała pierwszorzędowe: przeciwciało poliklonalne królika GFP (Sondy molekularne # A-6455), przeciwciało poliklonalne kurczaka przeciwko OMP (niestandardowe) (Chen i wsp., 2005), przeciwciało poliklonalne świnki morskiej przeciwko VGlut2 (Millipore# AB2251). Przeciwciała drugorzędowe: anty-królik osła sprzężony z Cy2 (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-sprzężony z osłem-anty-kurczak (Jackson Immunolab# 703-165-155) i Cy5-sprzężony kozioł anty-świnka morska (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sekcje zamontowano na szkiełkach z Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) z roztworem barwienia chromatyny DAPI o mocy 50 ng / mL. Obrazowanie konfokalne: Obrazy stosu Z wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego Olympus Flouview FV1000, a obrazy zebrano i przetworzono w projekcje 3D za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy konfokalnej Olympus FV10-ASW 2.01.