Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Podsumowanie

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Streszczenie

Badania nad patogenezą cukrzycy typu 2 oraz dysfunkcją wysepek Langerhansa ¹ były utrudnione ze względu na ograniczoną dostępność wysepek od dawców organów z cukrzycą typu 2². Przedstawiamy nasz protokół izolacji wysepek z tkanki trzustki ludzkiej pobranej od pacjentów z cukrzycą typu 2 oraz pacjentów bez cukrzycy, którzy przeszli częściową pancreatektomię z powodu różnych chorób trzustki (łagodnych lub złośliwych guzów trzustki, przewlekłego zapalenia trzustki oraz guzów przewodu żółciowego wspólnego lub dwunastnicy). Wszyscy uczestniczący pacjenci wyrazili zgodę na udział w badaniu, które zostało również zatwierdzone przez lokalny komitet etyki. Materiały chirurgiczne zostały niezwłocznie przekazane patologowi, który wybrał miękką i wyglądającą na zdrową tkankę trzustki do izolacji wysepek, zachowując tkankę uszkodzoną do celów diagnostycznych. Stwierdziliśmy, że aby wyizolować ponad 1000 wysepek, musieliśmy rozpocząć od co najmniej 2 g tkanki trzustki. Kluczowym elementem naszego protokołu było również widoczne rozciągnięcie tkanki podczas wstrzykiwania medium zawierającego enzymy, a następnie jej posiekanie, aby ułatwić trawienie poprzez zwiększenie powierzchni kontaktu.

Aby rozszerzyć zakres zastosowania naszego protokołu na rzadkie przypadki, w których dostępna jest duża ilość (>15g) tkanki trzustki ludzkiej, do trawienia tkanki użyliśmy komory Ricordiego (50 ml). Podczas trawienia ręcznie wstrząsaliśmy komorą Ricordiego³ z intensywnością zależną od stopnia włóknienia tkanki w danej próbce. Następnie zastosowano nieciągły gradient Ficollu w celu oddzielenia wysepek od tkanki acynarnej. Zauważyliśmy, że osad tkankowy powinien być na tyle mały, aby można go było homogenicznie resuspenderować w medium Ficoll o gęstości 1,125 g/ml. Po izolacji hodowaliśmy wysepki w warunkach wolnych od stresu (bez wstrząsania lub rotacji) w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez co najmniej 48 h, aby ułatwić ich regenerację funkcjonalną. Powszechne zastosowanie naszego protokołu i jego przyszłe udoskonalenie mogłyby umożliwić terminowe pozyskiwanie dużych ilości ludzkich wysepek od osób z cukrzycą oraz dopasowanych klinicznie osób niediabetycznych, co znacznie przyspieszyłoby badania nad cukrzycą typu 2.

Protokół

1. Pobieranie tkanki trzustki na sali operacyjnej

1. Chirurg wykonuje częściową resekcję trzustki.
2. Po umieszczeniu preparatu trzustki w pojemniku z lodem, należy niezwłocznie przekazać go patologowi.

2. Wybór tkanki do izolacji wysepek

1. Patolog wybiera tkankę, która wydaje się miękka i zdrowa, zachowując tkankę uszkodzoną do celów diagnostycznych. Tkanka włóknista oraz próbki zawierające mniej niż 2 g tkanki nadającej się do użycia są wykluczane z izolacji wysepek.
2. Zanurz tkankę trzustki w roztworze Euro Collins i dostarcz ją do laboratorium w transporcie w lodzie.

3. Izolacja ludzkich wysepek

1. Zważ tkankę trzustki, a następnie umieść ją w szalce o średnicy 10 cm.
2. Wlej 150 ml pożywki RPMI do kolby o pojemności 500 ml.
3. W kolbie o pojemności 250 ml przygotuj roztwór enzymów trawiennych, łącząc 130 ml pożywki RPMI z 100 mg/ml DNazy oraz 20 ml Liberazy RI w stężeniu 5mg/ml. Pobierz 10 ml tego roztworu do strzykawki w celu wstrzyknięcia go do tkanki trzustki.
4. Wstrzyknij roztwór enzymów trawiennych do tkanki trzustki tak, aby rozciągnąć ją jednorodnie. Jeśli uniemożliwia to zwłóknienie, trawienie prawdopodobnie nie powiedzie się. Następnie posiekaj tkankę na kawałki o rozmiarze ~4 mm³ na lodzie.

4. Obwód trawienia trzustki ludzkiej

1. Zmontować układ do trawienia zgodnie z rysunkiem 1. Kierunek przepływu w komorze Ricordiego jest w na dnie i na zewnątrz na górnej części komory.
2. Dolać pozostały roztwór enzymów trawiennych do kolby o pojemności 500 ml do osiągnięcia całkowitej objętości 300 ml i włożyć termometr.
3. Przenieś tkankę trzustkową do komory, włóż siatkę (średnica porów: 600 μm) oraz trzy kulki z azotku krzemu (średnica: 15 mm), zamknąć komorę i uruchomić pompę przy ustawionym przepływie 140 ml/min.
4. Gdy temperatura obwodu osiągnie 37 °Cnastępnie należy rozpocząć pomiar czasu i okresowo pobierać próbki, aby określić moment zakończenia trawienia. Barwienie dytyzonem (2 mg/ml) umożliwia wizualizację wysp trzustkowych w tkance poddanej trawieniu pod mikroskopem⁴.
5. Po oddzieleniu wysepek od otaczającej tkanki acinarnej należy szybko przerwać proces trawienia, umieszczając cewkę grzewczą w lodzie i dodając do układu 200 ml zimnego medium płuczącego (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozy i 10% FBS).
6. Zbierać roztwór wysepek do probótek stożkowych o pojemności 250 ml w miarę wypływania go z probówki z próbką. Kontynuować proces do momentu opróżnienia układu.

Rysunek 1. Obwód trawienia ludzkiej trzustki Obwód trawienia ludzkiej trzustki obejmuje komorę Ricordiego zawierającą siatkę (średnica porów: 600 μm) oraz trzy kulki z azotku krzemu (średnica: 15 mm). Odpływ z komory jest kierowany do kolby do zbierania tkanek za pomocą pompy perystaltycznej (140 ml/min). Strzałki wskazują kierunek przepływu. Optymalna temperatura trawienia enzymatycznego jest utrzymywana poprzez zanurzenie cewki grzejnej w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.

5. Płukanie po trawieniu

1. Odwiruj probówki stożkowe o pojemności 250 ml zawierające roztwór wysepek w temperaturze 4 °C przy 1000 rpm przez 5 min.
2. Odlej nadsącz, resuspenduj osad z wysepek w medium do przemywania (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozą i 10% FBS) i rozdziel go na równe frakcje do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. (Opcjonalnie: Rozdziel do dodatkowych probówek stożkowych w celu poprawy jakości przemywania). Odwiruj przy 1000 rpm, 4 °C przez 5 min.
3. Odlej nadsącz i delikatnie rozluźnij osady poprzez ręczne potrząsanie.

6. Oczyszczanie na gradiencie Ficoll

1. Resuspend osad w medium Ficoll o gęstości 1,125 g/ml, pH 7,4, a następnie powoli nałóż warstwami 10 ml aliquotów medium Ficoll o gęstościach 1,080, 1,060 i 1,037 g/ml.
2. Odwiruj gradienty Ficoll przy 2400 rpm, 4°C przez 20 min.

7. Izolacja i hodowla wysepek

1. Po odwirowaniu można rozróżnić poszczególne komponenty tkanki na podstawie ich rozmieszczenia w gradiencie.
2. Usunąć górną warstwę składającą się z tłuszczu i tkanki łącznej.
3. Ostrożnie zebrać pierwszą warstwę agregatów wysepek na interfazie 1,037-1,060 g/ml. Warstwa ta zawiera najczystsze izolowane wysepki. Frakcje należy zbierać osobno w celu zapewnienia wydajnej izolacji.
4. Zebrać drugą, mniej czystą frakcję agregatów wysepek na interfazie 1,060-1,080 g/ml.
5. Rozcieńczyć gradient Ficoll, dodając do każdej probówki stożkowej medium do płukania (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozy i 10% FBS) do uzyskania całkowitej objętości 50 ml. Wirować przy 1000 rpm w temperaturze 4°C przez 5 min.
6. Usunąć supernatant za pomocą odsysania. Należy zachować ostrożność, ponieważ osad może być niestabilny ze względu na gradient Ficoll.
7. Przepłukać osady medium do płukania (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozy i 10% FBS) i wirować przy 1000 rpm w temperaturze 4°C przez 5 min. Powtórzyć czynność, używając medium do hodowli wysepek.
8. Resuspendować wysepki w medium do hodowli i umieścić je w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C na 24-48 godzin przed dalszą obróbką.

Wyniki

Nasz protokół pozwolił na uzyskanie średnio ~500 wysepek na gram tkanki trzustki, choć wartość ta znacznie różniła się między preparatami, co wynikało głównie z różnic w stopniu włóknienia oraz aktywności kolagenazy. Osiągnęliśmy czystość wysepek > 90% poprzez wstępne barwienie dytyzonem podczas przetwarzania tkanki, a następnie ręczny wybór wysepek 24 godziny po izolacji. Aby określić jakość oczyszczonych wysepek, przeprowadziliśmy test wydzielania insuliny stymulowanego 25 mM glukozą w warunkach statycznych przez 2 godziny. Stwierdzono, że wydzielanie insuliny było porównywalne do poziomu uzyskiwanego z wysepek pochodzących z centrów izolacji i transplantacji wysepek ECIT. Ponieważ wysepki izolowane z trzustek po częściowej pancreatektomii nie są przeznaczone do transplantacji, ocenę całkowitego IEQ nie uznano za czynnik krytyczny.

Co istotne, nasza metoda pozwoliła nam na wyizolowanie wysepek do badań funkcjonalnych od 25 pacjentów po częściowej pancreatektomii w latach 2005–2008⁵. Wysepki te poddano analizie w kierunku insulinozależnej sekrecji glukozy oraz specyficznej ekspresji białek za pomocą techniki western blotting i immunohistochemii. Wysepki wyizolowane z trzustek po częściowej pancreatektomii mogą być również wykorzystane do porównania profili ekspresji genów i białek, wyglądu ultrastrukturalnego oraz odpowiedzi funkcjonalnych wysepek u osób zdrowych i chorych na cukrzycę. Ponieważ liczba pacjentów poddawanych częściowej pancreatektomii jest większa niż liczba dawców narządów, nasz protokół może umożliwić zgromadzenie wystarczającej liczby próbek i danych do przeprowadzenia rzetelnej analizy statystycznej.

Dyskusja

Stosując nasz protokół, można wyizolować ludzkie wysepki z tkanki trzustki pobranej podczas częściowej pankreatektomii. Sukces tego protokołu zależy od staranności zachowanej w kilku krytycznych punktach. Aby zachować żywotność komórek beta, niezbędne jest szybkie przetransportowanie próbki do laboratorium w lodzie. Ponadto czas trawienia tkanki musi zostać zoptymalizowany empirycznie, w zależności od stopnia włóknienia tkanki oraz aktywności enzymatycznej medium. Dotyczy to również siły mechanicznej przykładanej ręcznie do komory Ricordi. Zatem, aby uzyskać dobrą wydajność izolacji wysepek, protokół ten najlepiej przeprowadzić przez wyspecjalizowanego naukowca lub asystenta technicznego. Początkowe niepowodzenia są normą, chyba że zespół posiada już doświadczenie w izolacji wysepek.

Istnieją kluczowe różnice między naszym protokołem izolacji wysepek a standardową metodą izolacji ludzkich wysepek: 1) Choć wykorzystujemy tkankę trzustkową poddaną wielogodzinnej ischemii podczas procedury chirurgicznej, jest ona natychmiast przetwarzana na miejscu. Kontrastuje to z trzustkami pobranymi od dawców z potwierdzonym śmiercią mózgową w celu transplantacji trzustki/wysepek, które pozostają w stanie ischemii przez kilka godzin podczas alokacji i transportu do ośrodka izolacji wysepek. 2) Kolagenazę wstrzykujemy bezpośrednio do tkanki trzustki, podczas gdy w standardowym protokole podaje się ją do przewodów trzustkowych. 3) Wysepki oddzielamy przy użyciu nieciągłego gradientu Ficollu, zamiast zbierać je z ciągłego gradientu Ficollu za pomocą procesora komórkowego COBE.

W przypadkach, gdy materiał chirurgiczny jest zbyt zwłókniały lub zbyt mało obfity, aby wyizolować odpowiednią liczbę wysepek, tkankę można nadal pobrać za pomocą laserowej mikrosekcji (LCM)¹⁰. Pozwala to na odzyskanie danych o ekspresji genów z niemal każdego preparatu, nawet jeśli izolacja wysepek nie powiedzie się lub wydajność będzie bardzo niska. Niestety, LCM nie dostarcza żywych komórek do badań funkcjonalnych, a ich ilość jest zazwyczaj niewystarczająca do analiz proteomicznych. Zatem stosowanie LCM równolegle z naszym protokołem trawienia kolagenazą w celu odzyskania wysepek może być najskuteczniejszą metodą przetwarzania materiałów chirurgicznych.

Podczas pobierania tkanek do izolacji wysepek z zakresowych pancreatektomii ważne jest dokładne zbadanie historii klinicznej i stanu metabolicznego pacjenta. Pacjent po pancreatektomii zakresowej może cierpieć na cukrzycę typu 3c, czyli cukrzycę wtórną do schorzenia trzustki, które stało się przyczyną operacji⁶. Wśród 43 pacjentów, którzy zostali poddani tej operacji w naszym oddziale w 2010 roku, 32 nie miało cukrzycy, 5 cierpiało na cukrzycę typu 2, a 6 na cukrzycę typu 3c. Dane te są zgodne z wcześniejszymi badaniami wskazującymi na zaburzenia metabolizmu glukozy i cukrzycę u znacznej części pacjentów cierpiących na raka trzustki lub przewlekłe zapalenie trzustki⁶. Cukrzycę uznano za pierwotną, jeśli została zdiagnozowana co najmniej rok przed wystąpieniem objawów prowadzących do operacji trzustki⁷. Należy również zmierzyć poziom przeciwciał przeciwko autoantygenom wysepek, aby ocenić potencjalne autoimmunologiczne podłoże cukrzycy⁸. Ponieważ pacjent poddawany pancreatektomii może cierpieć na niezdiagnozowaną cukrzycę lub mieć zaburzenia tolerancji glukozy, wszyscy pacjenci bez cukrzycy powinni przejść doustny test tolerancji glukozy przed zabiegiem pancreatektomii⁹.