Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Podsumowanie

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Streszczenie

In vivo elektroporacja jest potężną metodą dostarczania plazmidów ekspresyjnych DNA, reagentów RNAi oraz antysensownych oligonukleotydów morfolinowych do specyficznych regionów rozwijających się embrionów, w tym C. elegans, kurczaka, Xenopus, danio pręgowanego oraz myszy ¹. W przypadku danio pręgowanego wykazano, że elektroporacja in vivo zapewnia doskonałą rozdzielczość przestrzenną i czasową w dostarczaniu tych reagentów ^2-7. Rozdzielczość czasowa tej metody jest istotna, ponieważ pozwala na wprowadzenie tych reagentów na konkretnych etapach rozwoju. Co więcej, ponieważ ekspresja z wektorów poddanych elektroporacji następuje w ciągu 6 godzin ⁷, metoda ta jest bardziej szybka niż podejścia transgeniczne. Choć rozdzielczość przestrzenna może być niezwykle precyzyjna przy celowaniu w pojedynczą komórkę ^{2, 6}, często preferowane jest wprowadzenie reagentów do konkretnej populacji komórek w obrębie tkanki lub struktury. Przy celowaniu w wiele komórek elektroporacja in vivo jest wydajna w dostarczaniu do konkretnego regionu embrionu; jednak, szczególnie w rozwijającym się układzie nerwowym, trudno jest celować w konkretne typy komórek wyłącznie poprzez przestrzennie dyskretną elektroporację. Alternatywnie, transgeniczne linie z pułapką wzmacniaczy (enhancer trap) oferują doskonałą ekspresję transgenów specyficzną dla typu komórek ⁸. W niniejszej pracy opisujemy podejście, które łączy transgeniczne linie pułapki wzmacniaczy oparte na Gal4 ⁸ z przestrzennie dyskretną elektroporacją in vivo ^{7, 9} w celu specyficznego celowania w rozwijające się neurony opuszki węchowej danio pręgowanego. Wcześniej opisana ⁸ linia pułapki wzmacniaczy Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)^hzm5 (dawniej GA80_9) wykazuje ukierunkowaną transgeniczną ekspresję mCherry zapośredniczoną przez zoptymalizowany dla danio pręgowanego aktywator transkrypcyjny Gal4 (KalTA4) w wielu regionach rozwijającego się mózgu, w tym w rombencefalonie, móżdżku, przodomózgowiu i opuszce węchowej. Aby skierować ekspresję GFP specyficznie do opuszki węchowej, plazmid z sekwencją kodującą GFP pod kontrolą wielu miejsc wiązania Gal4 (UAS) poddano elektroporacji w przedniej części przodomózgowia w 24-28 godzinach po zapłodnieniu (hpf). Chociaż metoda ta wprowadza plazmidowe DNA do wielu regionów przodomózgowia, ekspresja GFP jest indukowana tylko w komórkach transgenicznie wykazujących ekspresję czynnika transkrypcyjnego KalTA4. Zatem, dzięki zastosowaniu linii transgenicznej GA080_9, podejście to doprowadziło do ekspresji GFP wyłącznie w rozwijającej się opuszce węchowej. Komórki wykazujące ekspresję GFP, skierowane za pomocą tej metody, wykazały typowe projekcje aksonalne, jak wcześniej opisano dla komórek mitralnych opuszki węchowej ¹⁰. Metoda ta może być również wykorzystana do ukierunkowanego dostarczania innych reagentów, w tym plazmidów ekspresyjnych do interferencji RNA z krótkimi spinkami (shRNA), co zapewniłoby metodę przestrzennie i czasowo dyskretnej analizy utraty funkcji (loss-of-function).

Protokół

1. Zarodki transgeniczne

1. W niniejszym doświadczeniu wykorzystujemy transgeniczną linię danio pręgowanego, stworzoną za pomocą metody pułapki enhancerów zapośredniczonej przez transpozony ⁸. Wstawka transgeniczna zawiera dwie sekwencje kodujące: KalTA4, zoptymalizowaną dla danio pręgowanego wersję aktywatora transkrypcyjnego Gal4, oraz czerwone białko fluorescencyjne mCherry. Metoda pułapki enhancerów pozwala na uzyskanie linii transgenicznych danio pręgowanego, w których kaseta transgeniczna jest wyrażana pod kontrolą endogennej sekwencji enhancera. W związku z tym, w zależności od tożsamości konkretnej sekwencji enhancera, ekspresja zarówno KalTA4, jak i mCherry jest zlokalizowana w określonych obszarach rozwijającego się mózgu. Dla linii Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)^hzm5, której tutaj używamy, ekspresja jest zlokalizowana w kilku miejscach w rąbie, przedmózgowiu oraz, co jest tutaj szczególnie istotne, w opuszce węchowej ⁸ (patrz również Ryc. 1). Biorąc pod uwagę ten wzór ekspresji oraz lokalizację kasety w genomie, przewiduje się, że transgeny znajdują się pod kontrolą promotora zic4 ⁸ (patrz również http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main.).
2. Dorosłe ryby Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)^hzm5 heterozygotyczne pod kątem wstawki transgenicznej są zazwyczaj krzyżowane z rybami WT (AB), co daje około 50% potomstwa transgenicznego. (Aby uzyskać wyższy odsetek potomstwa transgenicznego, można skrzyżować dwa osobniki heterozygotyczne).
3. W celu zablokowania powstawania pigmentu i ułatwienia obrazowania fluorescencyjnego, należy traktować embriony transgeniczne 100 μM N-fenylotiomocznikiem (PTU), zaczynając od 6-8 hpf.

2. Montowanie zarodków

1. W 24-28 hpf przenieść zarodki do wody do jaj bez PTU. Zidentyfikować zarodki transgeniczne na podstawie ekspresji mCherry przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Usunąć błonę otoczkową z zarodków transgenicznych za pomocą precyzyjnej pęsety. Przenieść zarodki uwolnione z otoczki do szalki Petri zawierającej bufor do elektroporacji z dodatkiem 0,02% trikainy [Bufor do elektroporacji: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH 7,2] ⁴. Odczekać 2 minuty, aż środek znieczulający zacznie działać, przed przejściem do etapu montażu.
2. Przygotować 0,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze do elektroporacji z trikainą, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej, a następnie umieszczając go w inkubatorze w temperaturze 34-37°C. Po wyrównaniu temperatury roztworu agarozy, nanieść dużą kroplę (˜500 μl) roztworu agarozy na środek 60 mm szalki Petri. Dodać 6-8 znieczulonych zarodków do tej kropli agarozy.
3. Używając precyzyjnej pęsety (lub ostrych końców przeciętych końcówek pipet mikroloader), ustawić zarodki tak, aby wszystkie były skierowane w tym samym kierunku i wyrównane w pionowym rzędzie. Aby utwardzić agarozę i unieruchomić zarodki w tej pozycji, umieścić szalkę na większej szalce Petri z 2-3 mm lodu.
4. Po utwardzeniu agarozy zalać szalkę buforem do elektroporacji z trikainą, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa utwardzoną kroplę agarozy.

3. Mikrowstrzykiwanie plazmidu ekspresyjnego DNA

1. Przygotować plazmid ekspresyjny GFP, używając zestawu do izolacji plazmidów midi- lub maxi-prep (np. Qiagen). Zawiesić plazmid w wodzie sterylnej z dodatkiem 0,03% czerwieni fenolowej do końcowego stężenia 0,5 μg/μl. W opisanym tutaj eksperymencie celującym w opuszki węchowe stosujemy plazmid ekspresyjny z sekwencją kodującą EGFP pod kontrolą wielu miejsc wiązania Gal4 (14 tandemowych sekwencji UAS oraz podstawowego promotora rybiego E1b). Dzięki zastosowaniu tego plazmidu tylko komórki transgenicznie ekspresyjne dla czynnika transkrypcyjnego KalTA4 będą w stanie eksprimować GFP, co umożliwia ukierunkowaną ekspresję GFP.
   Uwaga: w tym przypadku używamy czerwieni fenolowej do wizualizacji iniekcji DNA, co powinno być możliwe w przypadku celowania w inne obszary rozwijającego się mózgu, o ile obszar ten jest dostępny z komór mózgu. Do celowania w inne typy komórek wymagające wizualizacji fluorescencyjnej, do wizualizacji iniekcji w oświetleniu fluorescencyjnym można potencjalnie zastosować barwniki Bodipy lub kropki kwantowe (Quantum Dot).
2. Pipety do mikroiniekcji można wykonać za pomocą horyzontalnego lub wertykalnego wyciągacza do pipet. Ustawienia temperatury i siły wyciągania będą się różnić w zależności od typu wyciągacza, rodzaju elementu grzejnego oraz rodzaju szklanych rurek kapilarnych.
   Używając wertykalnego wyciągacza Sutter P-30, należy ustawić temperaturę na 980 i siłę wyciągania na 960, aby uzyskać długie, zwężające się, ostre pipety z cienkościennego szkła borokrzemianowego z włóknami [Sutter Instrument #BF100-78]. Pipety do mikroiniekcji wyciągnięte przy tych ustawieniach są zamknięte i muszą zostać otwarte (poprzez kontrolowane przełamanie końcówki) przed iniekcją.
3. Za pomocą końcówki pipety typu microloader dodać 1-2 μl roztworu plazmidowego DNA do pipety do iniekcji.
4. Zamontować i zabezpieczyć napełnioną pipetę w uchwycie pipety systemu iniekcji ciśnieniowej.
5. Otwierać końcówkę napełnionej pipety za pomocą precyzyjnej pęsety, aż impulsy ciśnienia spowodują wypchnięcie czerwonego roztworu DNA. Alternatywnie, końcówki można otwierać poprzez szybkie przebicie zanurzonej, złożonej chusteczki laboratoryjnej Kimwipe.
   Uwaga: ponieważ pipety do iniekcji są początkowo zamknięte i muszą być otwierane ręcznie, rozmiar końcówki i objętość iniekcji są zmienne. Idealne pipety do iniekcji powinny wymagać 3-5 impulsów iniekcyjnych do całkowitego wypełnienia rozwijającego się komory przodomózgowia embrionów w 24 hpf (impulsy iniekcyjne 100 ms przy 40 psi).
6. Wstrzyknąć roztwór plazmidowego DNA do komór rozwijającego się mózgu w taki sposób, aby DNA zostało wtłoczone w obszar przyległy do regionu mózgu przeznaczonego do utworzenia opuszki węchowej i w jego obręb. Opuszka węchowa pochodzi z komórek znajdujących się w najbardziej przedniej ścianie komory przodomózgowia. Zatem poprzez wprowadzenie pipety do iniekcji do komór w taki sposób, aby pipeta była skierowana ku przedniej części rozwijającego się mózgu, iniekcja ciśnieniowa wtłacza DNA do i w sąsiedztwo przyszłej opuszki węchowej. Wstrzykiwać DNA, aż czerwony barwnik będzie wyraźnie widoczny w przedniej części komory przodomózgowia. Ponieważ DNA zaczyna dyfundować natychmiast, rozcieńczając się, ważne jest, aby przejść do etapu elektroporacji jak najszybciej po iniekcji (np. w ciągu 10 s).

4. Elektroporacja

1. Elektroporację przeprowadza się przy użyciu samodzielnie wykonanych elektrod z podskórnych elektrod platynowych Grass (Grass Technology #E2). Elektrody są przymocowane do ręcznej sondy, a końcowa odległość między elektrodami platynowymi powinna wynosić 1 mm (szczegóły konstrukcji znajdują się w ⁹). Impulsy elektroporacyjne o przebiegu prostokątnym są generowane poprzez podłączenie elektrod do stymulatora Grass SD-9 (Grass Technology, model SD-9).
2. Ustaw stymulator SD-9 tak, aby generował pojedyncze impulsy elektroporacyjne o czasie trwania 5 ms i napięciu 70 V. Ustaw elektrody w taki sposób, aby elektroda dodatnia znajdowała się przy przednim końcu zarodka, a elektroda ujemna za głową zarodka. Ręcznie wywołaj ok. 7-8 impulsów elektroporacyjnych, korzystając z przełącznika trybu pojedynczego stymulatora SD-9, zachowując odstęp ok. 1 s między każdym impulsem. Odpowiednie napięcia będą się różnić w zależności od wieku zarodków i używanego źródła napięcia. Młodsze zarodki wymagają niższych napięć, aby uniknąć ich uszkodzenia, natomiast starsze zarodki wymagają wyższych napięć do zainicjowania elektroporacji ⁷.
3. Po elektroporacji pozostaw zarodki do regeneracji na co najmniej 10 min przed uwolnieniem ich z agarozy.
4. Używając precyzyjnej pęsety, uwolnij zarodki z agarozy, delikatnie prowadząc wzdłuż ich obrysu, unikając bezpośredniego kontaktu z samymi zarodkami.
5. Po uwolnieniu przenieś zarodki do wody do jaj (z dodatkiem PTU, jeśli jest wymagane). Przechowuj je w temperaturze 28°C aż do momentu obrazowania ekspresji GFP.

5. Montowanie embrionów do obrazowania

1. Przenieść zarodki z wody do jaj wraz z PTU do wody do jaj z dodatkiem 0,02% tricaine. Odczekać kilka minut, aż środek znieczulający zacznie działać, przed przejściem do etapu montażu.
2. Przygotować 0,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie do jaj z dodatkiem tricaine, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej, a następnie umieszczając go w inkubatorze w temperaturze 34-37°C. Po wyrównaniu temperatury roztworu agarozy nanieść dużą kroplę (˜300 μl) roztworu agarozy na środek szalki Petriego o średnicy 35 mm. Dodać jeden znieczulony zarodek do tej kropli agarozy.
3. Używając precyzyjnej pęsety (lub cienkich końców przeciętych końcówek pipet mikroloader), ustawić zarodki w pozycji pionowej, tak aby możliwe było obrazowanie widoku grzbietowego rozwijającego się mózgu za pomocą mikroskopu biologicznego (mikroskopy odwrócone wymagają innego ustawienia zarodka oraz innej szalki umożliwiającej obrazowanie od dołu; patrz ¹²). Utwardzić agarozę, kładąc szalkę na większej szalce Petriego z 2-3 mm lodu. Podczas utwardzania prawdopodobnie konieczne będzie ponowne ustawienie zarodka precyzyjną pęsetą, aby upewnić się, że zarodek nie przechyli się na bok.
4. Po utwardzeniu agarozy zalać szalkę wodą do jaj z dodatkiem tricaine, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa utwardzoną kroplę agarozy.

6. Reprezentatywne wyniki:

Choć ekspresję GFP można zaobserwować już 6 godzin po elektroporacji, w tym przypadku przedstawiamy obrazy zarodka 4 dni po elektroporacji, aby struktura neurytów w komórkach docelowych była wystarczająco rozwinięta. Transgeniczna linia pułapki enhancerowej Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)^hzm5 wykazuje konstytutywną ekspresję mCherry (oraz KalTA4) w rombencefhalonie, móżdżku, przodomózgowiu i opuszce węchowej w zarodkach w 5. dniu po zapłodnieniu (Rys. 1A i 1C). Zarodki, do których za pomocą ukierunkowanej elektroporacji (opisanej powyżej) wprowadzono plazmid ekspresyjny UAS-GFP, wykazują ekspresję GFP ograniczoną do komórek rozwijającej się opuszki węchowej (Rys. 1B, 1D i 1E). Tylko komórki transgenicznie eksponujące czynnik transkrypcyjny KalTA4 są w stanie aktywować ekspresję z tego plazmidu UAS-GFP. Wprowadzenie tego plazmidu do zarodków nietransgenicznych nie prowadzi do jakiejkolwiek wykrywalnej ekspresji GFP. Zatem to połączone działanie ukierunkowanej elektroporacji UAS-GFP oraz lokalnej transgenicznej ekspresji drivera KalTA4 prowadzi do wyłącznej ekspresji GFP w komórkach rozwijającej się opuszki węchowej. Komórki wykazujące ekspresję GFP prezentują typowe projekcje aksonalne komórek mitralnych opuszki węchowej (Rys. 1B i 1D) ¹⁰. W celu wizualizacji projekcji aksonów, obrazy na Rys. 1B i 1D musiały zostać naświetlone z wysoką ekspozycją, przez co regiony ciał komórkowych zostały znacznie prześwietlone. Niższy poziom ekspozycji (Rys. 1E) pokazuje, że ciała komórkowe wykazujące ekspresję GFP są rzeczywiście zlokalizowane w opuszce węchowej (porównać Rys. 1C i 1E; szara linia oznacza granicę opuszki węchowej).

Rycina 1. Celowana ekspresja GFP w opuszce węchowej zarodka zebrafish w 5. dobie po zapłodnieniu (dpf). Transgeniczna linia pułapki enhancerowej Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)^hzm5 wykazuje konstytutywną ekspresję mCherry w rombence, móżdżku, przedmózgowiu i opuszce węchowej (A i C, fluorescencja mCherry zaznaczona kolorem czerwonym). Ekspresja mCherry jest pośredniczona przez transgeniczną ekspresję Gal4. Zarodki poddane elektroporacji wektorem ekspresyjnym UAS-GFP w 28. godzinie po zapłodnieniu (hpf) wykazują celowaną ekspresję GFP w opuszce węchowej w 5. dobie po zapłodnieniu (B, D i E, fluorescencja GFP zaznaczona kolorem zielonym; ten sam zarodek co na zdjęciach A i C). Obraz z krótszym czasem ekspozycji na dole (E) pokazuje, że ekspresja GFP jest ograniczona do ciał komórkowych opuszki węchowej. Szara linia oznacza granicę opuszki węchowej. Obrazy w jasnym polu (skala szarości), fluorescencja zielona (zielony) i fluorescencja czerwona (czerwony) zostały wykonane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX60.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano metodę elektroporacji in vivo u ryb zebrafish, która wykorzystuje transgeniczną linię Gal4 z pułapką wzmacniacza (enhancer trap) w celu ukierunkowania ekspresji elektroporowanego transgenu na konkretną populację komórek w rozwijającej się opłocie węchowej. Podejście to łączy doskonałą rozdzielczość czasową elektroporacji in vivo ⁷ z ekspresją specyficzną dla typu komórek, pośredniczoną przez transgeniczne linie z pułapką wzmacniacza ⁸. Chociaż w tym przypadku opisano celowanie w opłot węchowy, elektroporację in vivo można wykorzystać do celowania w inne obszary rozwijającego się układu nerwowego ^2-7, a dostępne są linie z pułapką wzmacniacza z ukierunkowaną ekspresją Gal4 w wielu różnych specyficznych typach komórek lub tkankach ^{8, 11}. Oczywiście technika elektroporacji ta powinna być odpowiednia również dla innych kombinatorycznych podejść genetycznych, takich jak systemy LexA lub Tet ^{13, 14, 15}. Główną zaletą elektroporacji jest brak konieczności tworzenia dodatkowych linii transgenicznych, pod warunkiem dostępności odpowiedniej linii Gal4. Pozwala to zaoszczędzić sześć miesięcy.

In vivo elektroporacja umożliwia wprowadzenie oligonukleotydów do neuronów i ich prekursorów na dowolnym, wybranym etapie rozwoju układu nerwowego ⁷. Taka rozdzielczość czasowa jest szczególnie korzystna w analizach utraty funkcji (loss-of-function), ponieważ pozwala uniknąć problemów związanych z celowaniem w geny pełniące kluczowe funkcje na wcześniejszych etapach rozwoju. Opisana tutaj metoda może być również wykorzystana do wprowadzania odczynników powodujących utratę funkcji, w tym oligonukleotydów lub konstruktów RNAi oraz antysensownych oligonukleotydów morfolinowych ^{4, 7}. Odczynniki oparte na plazmidach, takie jak plazmidy do ekspresji białek dominantowo-negatywnych lub plazmidy RNAi z krótkimi spinkami (shRNA), mogą być również pod kontrolą systemu Gal4 UAS, co umożliwia precyzyjną, specyficzną dla typu komórek ekspresję, którą zaprezentowano tutaj na przykładzie ekspresji GFP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki: Agaroza niskotopliwa (Sigma, A9414) Zestaw do midi- lub maxi-prep plazmidów (np. Qiagen, #12643) Czerwień fenolowa (Sigma, P3532) Sprzęt: Kapilara szklana z włóknem; średnica wewnętrzna (ID) = 0,78 mm; średnica zewnętrzna (OD) = 1,0 mm (Sutter Instruments, #BF100-78-10) stymulator Grass SD-9 (Grass Technology, Model SD-9) Podskórne elektrody platynowe Grass, igła prosta (Grass Technology, #E2) Końcówki do mikrodozownika (Eppendorf, #X22703R) Wytciągacz pipet (np. Sutter, model P-30) Wytciągacz pipet (np. Sutter, model P-30)