Artykuł metodologiczny

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2965

⸱

18 lipca 2011

 , 
1Division of Cell Biology and Genetics, House Ear Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.

Streszczenie

Komórki słupkowe zewnętrzne (OHCs) to cylindryczne komórki sensoromotoryczne znajdujące się w narządzie Cortiego, organie słuchu wewnątrz ucha wewnętrznego ssaków. Nazwa „komórki słupkowe” pochodzi od charakterystycznego dla nich apikalnego pęczka stereociliów, który jest kluczowym elementem wykrywania i transdukcji energii dźwiękowej 1. OHCs potrafią zmieniać kształt — wydłużać się, skracać i wyginać — w odpowiedzi na stymulację elektryczną, mechaniczną i chemiczną; reakcja motoryczna ta jest uważana za kluczową dla wzmocnienia ślimakowego sygnałów akustycznych 2.

Stymulacja OHC indukuje dwie różne odpowiedzi ruchowe: i) elektromotylność, znaną również jako motylność szybka, czyli zmiany długości w zakresie mikrosekund wynikające z napędzanych elektrycznie zmian konformacyjnych białek motorowych gęsto upakowanych w błonie plazmatycznej OHC, oraz ii) motylność wolną, czyli zmiany kształtu w zakresie od milisekund do sekund obejmujące reorganizację cytoszkieletu 2, 3. Zginanie OHC jest związane z elektromotylnością i wynika albo z asymetrycznego rozkładu białek motorowych w bocznej błonie plazmatycznej, albo z asymetrycznej stymulacji elektrycznej tych białek motorowych (np. za pomocą pola elektrycznego prostopadłego do długiej osi komórek) 4. Bodźce mechaniczne i chemiczne indukują zasadniczo wolne odpowiedzi ruchowe, mimo że zmiany w warunkach jonowych komórek i/lub ich otoczenia mogą również stymulować białka motorowe osadzone w błonie plazmatycznej 5, 6. Ponieważ odpowiedzi ruchowe OHC są istotnym elementem wzmacniacza ślimakowego, jakościowa i ilościowa analiza tych odpowiedzi w częstotliwościach akustycznych (w przybliżeniu od 20 Hz do 20 kHz u ludzi) jest bardzo ważną kwestią w badaniach nad słuchem 7.

Rozwój nowej technologii obrazowania, łączącej szybkie kamery wideo, systemy oświetlenia oparte na diodach LED oraz zaawansowane oprogramowanie do analizy obrazu, umożliwia obecnie przeprowadzanie wiarygodnych badań jakościowych i ilościowych odpowiedzi ruchowej izolowanych OHC na zewnętrzne zmienne pole elektryczne (EAEF) 8. Jest to prosta i nieinwazyjna technika, która pozwala uniknąć większości ograniczeń występujących w poprzednich podejściach 9-11. Co więcej, system oświetlenia oparty na diodach LED zapewnia wyjątkową jasność przy nieznacznych efektach termicznych w próbkach, a dzięki zastosowaniu mikroskopii wideo rozdzielczość optyczna jest co najmniej 10-krotnie wyższa niż w przypadku konwencjonalnych technik mikroskopii świetlnej 12. Przykładowo, przy użyciu opisanego tutaj zestawu doświadczalnego, zmiany długości komórek rzędu 20 nm mogą być rutynowo i wiarygodnie wykrywane przy częstotliwościach 10 kHz, a rozdzielczość tę można dodatkowo poprawić przy niższych częstotliwościach.

Jesteśmy przekonani, że to podejście eksperymentalne pomoże w poszerzeniu naszej wiedzy na temat komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw ruchliwości OHC.

Protokół

1. Izolacja OHC

  1. Procedurę należy rozpocząć od pobrania kości skroniowych od świnek morskich, myszy lub innego ssaczego modelu zwierzęcego.
  2. Następnie należy otworzyć kości skroniowe za pomocą kleszczyków do młoteczków w celu odsłonięcia ślimaka, a następnie zanurzyć je w pożywce Leibovitz L-15. Należy ostrożnie usunąć nadmiar kostny, zachowując nienaruszoną strukturę skorupy kostnej. Ponieważ jest to ogólna procedura stosowalna do kości skroniowych dowolnego gatunku ssaka, przy pracy z kośćmi skroniowymi bardzo małych zwierząt mogą być konieczne niewielkie modyfikacje techniki. U starszych zwierząt bąbelek słuchowy jest zazwyczaj zwapniały, co stanowi dodatkowe utrudnienie w procedurze.
  3. Pod kontrolą mikroskopową należy otworzyć obszar szczytowy ślimaka i usunąć prążkowanie naczyniowe oraz więzadło spiralne, używając końcówki ostrza skalpela nr 11, mikroigły oraz precyzyjnej pęsety.
  4. Organ Corti należy oddzielić od modiolusa ślimaka za pomocą pęsety i umieścić go w roztworze kollagenazy 1mg/ml w pożywce L-15 w temperaturze pokojowej na 5 min.
  5. W przypadku potrzeby pobrania OHC z podstawowych zwojów ślimaka, należy usunąć za pomocą mikroigły skorupę kostną pokrywającą podstawę ślimaka, a następnie oddzielić spiralę od kości skroniowej za pomocą ostrza skalpela przed usunięciem Organu Corti.
  6. Organ Corti należy przenieść do komory rejestracyjnej za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μL. Następnie należy zdysocjować komórki poprzez przepływ zwrotny przez igłę.

2. Układ eksperymentalny

  1. Schemat generatora zewnętrznego zmiennego pola elektrycznego (EAEF) oraz jego połączeń z systemem przechwytywania obrazu (Rys. 1). Układ sterujący został specjalnie opracowany w Engineering Core House Ear Institute.
  2. Układ eksperymentalny wykorzystany w naszych badaniach składa się z odwróconego mikroskopu Axiovert 135TV (Zeiss, Thornwood, NY) z alternatywnym systemem oświetlenia LED (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), dwóch elektronicznych mikromanipulatorów (Eppendorf „Patchman”, Niemcy), sterowanej przez PC ultraszybkiej kamery Photron Fastcam X 1024 PCI (Photron USA Inc.) w porcie Kellera oraz dodatkowej zwykłej kamery CCD w porcie trynocularnym. Kamera Fastcam umożliwia przechwytywanie obrazów z wysoką częstotliwością (do 100 000 fps) i wysoką rozdzielczością (np. 1024 x 1024 piksele przy 1 000 fps, 512 x 128 przy 10 000 fps, 384 x 96 przy 18 000 fps itd.). Obrazy dostarczane przez szybką kamerę są obserwowane bezpośrednio na monitorze PC, natomiast kamera CCD jest podłączona do innego monitora. System oświetlenia LED pracuje w dwóch różnych trybach: analogowym o niskiej mocy i cyfrowym o wysokiej mocy. Wszystkie procedury wstępne (pozycjonowanie elektrod, pozycjonowanie komórki, ustawianie ostrości itp.) są wykonywane w analogowym trybie o niskiej mocy. Oświetlenie o wysokiej mocy jest włączane przez otwarcie migawki kamery, a następnie wyłączane przez jej zamknięcie, co ułatwia odprowadzanie ciepła. Autorskie oprogramowanie, opracowane również w Engineering Core House Ear Institute i działające na tym samym komputerze PC, steruje wyzwalaczem szybkiej kamery, systemem oświetlenia LED oraz EAEF. Konwencjonalny cyfrowy aparat fotograficzny w przednim porcie umożliwia wykonywanie pojedynczych klatek w razie potrzeby. (Rys. 2 A).
  3. Elektrody (dwa druty Ag o średnicy 0,25 mm z odległością końcówek wynoszącą 0,8 mm) są przemieszczane do odpowiedniej pozycji za pomocą jednego z elektronicznych mikromanipulatorów. Położenie elektrod jest monitorowane wizualnie oraz poprzez obraz mikroskopowy; zmiana płaszczyzny ogniskowania obrazu wskazuje, że elektrody dotknęły dna komory eksperymentalnej. Początkowo pole elektryczne jest kalibrowane za pomocą zewnętrznej elektrody. Elektroda ta mierzy potencjał elektryczny w różnych punktach, tworząc „mapę” pola elektrycznego. Jeśli pojedyncza izolowana komórka włókienstowata zewnętrzna zostanie umieszczona między końcówkami elektrod tak, aby jej oś podłużna była równoległa do przyłożonego EAEF, będzie ona poruszać się, wydłużając się i skracając z częstotliwością pola elektrycznego. Jeśli komórka zostanie umieszczona prostopadle do pola, można zaobserwować i zbadać inny rodzaj odpowiedzi OHC (wyginanie). (Rys. 2 B)

3. Stymulacja EAEF i rejestracja obrazu

  1. Można wybrać cztery różne protokoły stymulacji (Ryc. 3):
    1. ciągła pojedyncza częstotliwość (Ryc. 3 A). Należy zauważyć, że tryb stymulacji, częstotliwość, amplituda i typ fali mogą być wybierane przy użyciu autorskiego oprogramowania sterującego (czerwone okręgi).
    2. paczkowa pojedyncza częstotliwość (Ryc. 3 B). Możliwy jest również wybór długości paczek oraz przerw między paczkami.
    3. liniowy sweep (Ryc. 3 C). Wybieralne są częstotliwości początkowa i końcowa.
    4. wielostymulacja (Ryc. 3 D). Pojedynczą częstotliwość oraz liniowe sweepy można łączyć w ramach jednego eksperymentu. Po wybraniu odpowiednich parametrów oprogramowanie sterujące konfiguruje system i pozwala operatorowi na rozpoczęcie zsynchronizowanej z oświetleniem rejestracji wideo oraz stymulacji komórek poprzez kliknięcie jednego przycisku na ekranie komputera.
  2. Obrazy są przechwytywane w formacie AVI w celu dalszej analizy przy wysokich częstotliwościach.

4. Reprezentatywne wyniki

  1. W tym filmie dwie izolowane komórki włoskowate zewnętrzne wykazują zmiany długości lub krzywizny podczas stymulacji zewnętrznym zmiennym polem elektrycznym, które jest odpowiednio równoległe lub poprzeczne do ich osi podłużnej. (Film nr 2).
  2. Reakcje ruchowe OHC są analizowane w trybie off-line przy użyciu oprogramowania ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). Funkcja „Feature Tracking” w tym oprogramowaniu dostarcza odległość między dwoma punktami klatka po klatce (Ryc. 4). Podczas skracania się komórki odległość między punktami wybranymi w szczycie (blaszka kutykularna; kolor czerwony) i u podstawy komórki (biegun bazalny; kolor zielony) jest mniejsza, a następnie zwiększa się wraz z wydłużaniem komórki. Film przedstawia analizę zmian długości klatka po klatce przez oprogramowanie. Panel na dole obrazu pokazuje przebieg ruchu. W tym przykładzie całkowita zmiana długości wynosi około 6,5 piksela.
  3. Funkcja „Contour Tracking” w oprogramowaniu ProAnalyst pozwala na wykrycie krawędzi komórki i automatyczny pomiar powierzchni przekroju optycznego (Ryc. 5).
  4. Polistyrenowe mikrosfery dodane do roztworu kąpieli przylegają losowo i trwale do błony plazmatycznej (Ryc. 6 A). Można jednocześnie wybrać różne mikrosfery, a oprogramowanie może automatycznie śledzić je wszystkie klatka po klatce. W ten sposób komórki można podzielić na sekcje i niezależnie ocenić ruchliwość każdej z nich. (Ryc. 6 A)
  5. Poprzez wybór mikrosfer znajdujących się na bocznych krawędziach obrazu komórki, można również niezależnie ocenić zmiany długości każdego segmentu oraz zmiany kąta jednego segmentu względem drugiego (wyginanie). (Ryc. 6B)

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat generatora EAEF oraz jego połączeń z systemem przechwytywania obrazu.

figure-protocol-2
Rysunek 2. A) Zdjęcie układu eksperymentalnego. B) Szczegół stołu mikroskopowego wraz ze schematami przedstawiającymi elektrody oraz pojedynczą OHC umieszczoną pomiędzy nimi, z osią podłużną równolegle do pola elektrycznego.

figure-protocol-3
Rysunek 3. A) Interfejs użytkownika własnego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do stymulacji jednoczęstotliwościowej. Wybrane parametry zostały zaznaczone czerwoną obwódką. B) Interfejs użytkownika własnego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do seryjnej stymulacji jednoczęstotliwościowej. C) Interfejs użytkownika własnego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do stymulacji metodą sweep liniowego. D) Interfejs użytkownika własnego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do wielokrotnej stymulacji.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Pojedyncza klatka obrazu OHC z dwoma punktami wybranymi odpowiednio u podstawy (zielony) i w wierzchołku (czerwony) komórki, przy użyciu funkcji „Feature tracking” oprogramowania ProAnalyst. Krzywa poniżej komórki przedstawia okresowe zmiany odległości między wybranymi punktami związane ze stymulacją elektryczną. Przesuwając pionowy pasek, można wybrać różne klatki do indywidualnej analizy.

figure-protocol-5
Rysunek 5. Funkcja „Contour Tracking” w programie ProAnalyst wykrywa krawędź komórki i automatycznie mierzy powierzchnię przekroju optycznego.

figure-protocol-6
Rysunek 6. A) Przechwycony obraz izolowanej OHC udekorowanej mikrosferami polistyrenowymi (góra) oraz ten sam obraz z pięcioma indywidualnie wybranymi mikrosferami (dół). Każdej mikrosferze przypisano inny kolor, a ich przemieszczenia mogą być śledzone indywidualnie i automatycznie klatka po klatce, analizowane oraz porównywane. B) Segmenty o dowolnej długości można zdefiniować poprzez wybór mikrosfer polistyrenowych znajdujących się na krawędziach komórki, a zmiany długości tych segmentów, jak również zmiany orientacji jednego segmentu względem pozostałych (wyginanie komórki), mogą być automatycznie oceniane klatka po klatce za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Film 1. Izolacja zewnętrznych komórek słuchowych (OHC) świnki morskiej. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Film 2. Komórki zewnętrznej listki (OHC) ustawione równolegle i prostopadle do EAEF, wykazujące typowe odpowiedzi w postaci elektromobilności i wyginania. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda eksperymentalna umożliwia szacowanie odpowiedzi motorycznych OHC w zakresie kHz bez żadnych ograniczeń ruchu komórki. Różne protokoły stymulacji, dodatkowe markery (mikrosfery), a także zmiany w orientacji komórki względem pola elektrycznego pozwalają na badanie nowych aspektów motylości OHC z poziomem szczegółowości, który był wcześniej nieosiągalny. Inne metody, np. te wykorzystujące fotodiody 9 lub laserową wibrometrię dopplerowską 10, wymagają ścisłej kontroli położeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca wspierana przez granty National Institutes of Health R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Research Core oraz HEI. Jej treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne stanowisko NIH lub HEI. Autorzy deklarują brak istniejącego lub potencjalnego konfliktu interesów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka Leibovitz’s L-15 GIBCO, by Life Technologies21083
Kolagenaza (typ 4)Sigma-AldrichC51381mg/mL w L-15

Bibliografia

  1. Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
  2. Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
  3. Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
  4. Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
  5. Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
  6. Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
  7. Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
  8. Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
  9. Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
  10. Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
  11. Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
  12. Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

zewn trzne kom rki rz sateelektromotylnopowolna motylnoanaliza motylno ci kom rekwzmocnienie limakowezginanie kom rek rz satychsekcja ko ci skroniowejtraktowanie kolagenaz

Powiązane artykuły