Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki słupkowe zewnętrzne (OHCs) to cylindryczne komórki sensoromotoryczne znajdujące się w narządzie Cortiego, organie słuchu wewnątrz ucha wewnętrznego ssaków. Nazwa „komórki słupkowe” pochodzi od charakterystycznego dla nich apikalnego pęczka stereociliów, który jest kluczowym elementem wykrywania i transdukcji energii dźwiękowej 1. OHCs potrafią zmieniać kształt — wydłużać się, skracać i wyginać — w odpowiedzi na stymulację elektryczną, mechaniczną i chemiczną; reakcja motoryczna ta jest uważana za kluczową dla wzmocnienia ślimakowego sygnałów akustycznych 2.
Stymulacja OHC indukuje dwie różne odpowiedzi ruchowe: i) elektromotylność, znaną również jako motylność szybka, czyli zmiany długości w zakresie mikrosekund wynikające z napędzanych elektrycznie zmian konformacyjnych białek motorowych gęsto upakowanych w błonie plazmatycznej OHC, oraz ii) motylność wolną, czyli zmiany kształtu w zakresie od milisekund do sekund obejmujące reorganizację cytoszkieletu 2, 3. Zginanie OHC jest związane z elektromotylnością i wynika albo z asymetrycznego rozkładu białek motorowych w bocznej błonie plazmatycznej, albo z asymetrycznej stymulacji elektrycznej tych białek motorowych (np. za pomocą pola elektrycznego prostopadłego do długiej osi komórek) 4. Bodźce mechaniczne i chemiczne indukują zasadniczo wolne odpowiedzi ruchowe, mimo że zmiany w warunkach jonowych komórek i/lub ich otoczenia mogą również stymulować białka motorowe osadzone w błonie plazmatycznej 5, 6. Ponieważ odpowiedzi ruchowe OHC są istotnym elementem wzmacniacza ślimakowego, jakościowa i ilościowa analiza tych odpowiedzi w częstotliwościach akustycznych (w przybliżeniu od 20 Hz do 20 kHz u ludzi) jest bardzo ważną kwestią w badaniach nad słuchem 7.
Rozwój nowej technologii obrazowania, łączącej szybkie kamery wideo, systemy oświetlenia oparte na diodach LED oraz zaawansowane oprogramowanie do analizy obrazu, umożliwia obecnie przeprowadzanie wiarygodnych badań jakościowych i ilościowych odpowiedzi ruchowej izolowanych OHC na zewnętrzne zmienne pole elektryczne (EAEF) 8. Jest to prosta i nieinwazyjna technika, która pozwala uniknąć większości ograniczeń występujących w poprzednich podejściach 9-11. Co więcej, system oświetlenia oparty na diodach LED zapewnia wyjątkową jasność przy nieznacznych efektach termicznych w próbkach, a dzięki zastosowaniu mikroskopii wideo rozdzielczość optyczna jest co najmniej 10-krotnie wyższa niż w przypadku konwencjonalnych technik mikroskopii świetlnej 12. Przykładowo, przy użyciu opisanego tutaj zestawu doświadczalnego, zmiany długości komórek rzędu 20 nm mogą być rutynowo i wiarygodnie wykrywane przy częstotliwościach 10 kHz, a rozdzielczość tę można dodatkowo poprawić przy niższych częstotliwościach.
Jesteśmy przekonani, że to podejście eksperymentalne pomoże w poszerzeniu naszej wiedzy na temat komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw ruchliwości OHC.
Protokół
1. Izolacja OHC
- Procedurę należy rozpocząć od pobrania kości skroniowych od świni morskich, myszy lub innego ssaczego modelu zwierzęcego.
- Następnie należy otworzyć kości skroniowe za pomocą kleszczyków do młoteczków, aby odsłonić ślimaka, i zanurzyć je w pożywce Leibovitz L-15. Należy ostrożnie usunąć nadmiar kości, zachowując nienaruszoną otoczkę kostną. Choć jest to ogólna procedura stosowana do kości skroniowych dowolnego gatunku ssaków, w przypadku bardzo małych zwierząt mogą być konieczne niewielkie modyfikacje techniki. U starszych zwierząt bąbelek słuchowy jest zazwyczaj zwapniały, co stanowi dodatkową komplikację w przebiegu procedury.
- Pod obserwacją mikroskopową należy otworzyć region wierzchołkowy ślimaka i usunąć prążkowaną błonę naczyniową oraz więzadło spiralne, używając ostrza skalpela nr 11, mikroigły oraz precyzyjnej pęsety.
- Za pomocą pęsety należy oddzielić narząd Cortiego od modiolusa ślimaka i umieścić go w roztworze kollagenazy 1mg/ml w pożywce L-15 w temperaturze pokojowej na 5 min.
- Jeśli potrzebne są OHC z podstawowych zwojów ślimaka, należy usunąć igłą otoczkę kostną pokrywającą podstawę ślimaka, a następnie oddzielić spiralę od kości skroniowej za pomocą ostrza skalpela przed usunięciem narządu Cortiego.
- Narząd Cortiego należy przenieść do komory rejestracyjnej za pomocą strzykawki Hamiltona 50 μL. Następnie należy zdysocjować komórki poprzez przepływ zwrotny przez igłę.
2. Układ eksperymentalny
- Schemat generatora zewnętrznego przemiennego pola elektrycznego (EAEF) oraz jego połączeń z systemem przechwytywania obrazu (Rys. 1). Układ sterujący został specjalnie opracowany w dziale inżynieryjnym (Engineering Core) House Ear Institute.
- Układ eksperymentalny wykorzystany w naszych badaniach składa się z odwróconego mikroskopu Axiovert 135TV (Zeiss, Thornwood, NY) z alternatywnym systemem oświetlenia LED (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), dwóch elektronicznych mikromanipulatorów (Eppendorf "Patchman", Niemcy), sterowanej komputerowo ultraszybkiej kamery Photron Fastcam X 1024 PCI (Photron USA Inc.) w porcie Kellera oraz dodatkowej standardowej kamery CCD w porcie trynokularnym. Kamera Fastcam umożliwia przechwytywanie obrazów z wysoką częstotliwością (do 100 000 fps) i wysoką rozdzielczością (np. 1024 x 1024 pikseli przy 1 000 fps, 512 x 128 przy 10 000 fps, 384 x 96 przy 18 000 fps itd.). Obrazy z kamery wysokiej prędkości są obserwowane bezpośrednio na monitorze komputera, natomiast kamera CCD jest podłączona do innego monitora. System oświetlenia LED pracuje w dwóch różnych trybach: analogowym o niskiej mocy i cyfrowym o wysokiej mocy. Wszystkie procedury wstępne (pozycjonowanie elektrod, pozycjonowanie komórki, ustawianie ostrości itp.) są wykonywane w trybie analogowym o niskiej mocy. Oświetlenie o wysokiej mocy jest włączane przez otwarcie migawki kamery, a następnie wyłączane przez jej zamknięcie, co ułatwia odprowadzanie ciepła. Własnoręcznie opracowane oprogramowanie, stworzone również w dziale inżynieryjnym House Ear Institute i uruchomione na tym samym komputerze, steruje wyzwalaczem kamery wysokiej prędkości, systemem oświetlenia LED oraz EAEF. Standardowy cyfrowy aparat fotograficzny w przednim porcie umożliwia wykonywanie pojedynczych klatek w razie potrzeby (Rys. 2 A).
- Elektrody (dwa druty Ag o średnicy 0.25 mm z odległością między końcówkami 0.8 mm) są pozycjonowane za pomocą jednego z elektronicznych mikromanipulatorów. Położenie elektrod jest monitorowane wizualnie oraz za pomocą obrazu mikroskopowego; zmiana płaszczyzny ogniskowej obrazu wskazuje, że elektrody dotknęły dna komory eksperymentalnej. Początkowo pole elektryczne jest kalibrowane za pomocą zewnętrznej elektrody. Elektroda ta mierzy potencjał elektryczny w różnych punktach, tworząc „mapę” pola elektrycznego. Jeśli pojedyncza izolowana zewnętrzna komórka rzęsata zostanie umieszczona między końcówkami elektrod w taki sposób, aby jej oś podłużna była równoległa do przyłożonego EAEF, będzie ona ulegać wydłużaniu i skracaniu z taką samą częstotliwością jak pole elektryczne. Jeśli komórka zostanie umieszczona prostopadle do pola, można zaobserwować i zbadać inny rodzaj odpowiedzi OHC (zginanie) (Rys. 2 B).
3. Stymulacja EAEF i rejestracja obrazu
- Możliwy jest wybór czterech różnych protokołów stymulacji (Ryc. 3):
- ciągła pojedyncza częstotliwość (Ryc. 3 A). Należy zauważyć, że tryb bodźca, częstotliwość, amplituda i typ fali mogą zostać wybrane za pomocą autorskiego oprogramowania sterującego (czerwone okręgi).
- paczkowa pojedyncza częstotliwość (Ryc. 3 B). Długość paczek oraz przerwy między nimi są również konfigurowalne.
- liniowy sweep (Ryc. 3 C). Możliwy jest wybór częstotliwości początkowej i końcowej.
- wielostymulacja (Ryc. 3 D). Pojedyncza częstotliwość oraz linearne sweepy mogą zostać połączone w ramach jednego eksperymentu. Po wybraniu odpowiednich parametrów oprogramowanie sterujące konfiguruje system i umożliwia operatorowi rozpoczęcie zsynchronizowanego z oświetleniem nagrywania wideo oraz stymulację komórek za pomocą jednego kliknięcia przycisku na ekranie komputera.
- Obrazy są rejestrowane w formacie AVI w celu dalszej analizy przy wysokich częstotliwościach.
4. Reprezentatywne wyniki
- W tym filmie dwie izolowane komórki włókniątkowate zewnętrzne wykazują zmiany długości lub krzywizny podczas stymulacji zewnętrznym zmiennym polem elektrycznym, które jest odpowiednio równoległe lub poprzeczne do ich osi podłużnej. (Film #2).
- Ruchowe odpowiedzi OHC są analizowane offline przy użyciu oprogramowania ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). Funkcja „Feature Tracking” w tym oprogramowaniu określa odległość między dwoma punktami klatka po klatce (Ryc. 4). Podczas skracania się komórki odległość między punktami wybranymi na wierzchołku (blaszka kutykularna; kolor czerwony) i u podstawy komórki (biegun podstawny; kolor zielony) jest mniejsza i zwiększa się wraz z wydłużaniem komórki. Film przedstawia analizę zmian długości klatka po klatce za pomocą oprogramowania. Panel na dole obrazu pokazuje zapis ruchu. W tym przykładzie całkowita zmiana długości wynosi około 6,5 piksela.
- Funkcja „Contour Tracking” w oprogramowaniu ProAnalyst pozwala wykryć krawędź komórki i automatycznie zmierzyć pole powierzchni przekroju optycznego (Ryc. 5).
- Polistyrenowe mikrosfery dodane do roztworu kąpieli przylegają losowo i trwale do błony plazmatycznej (Ryc. 6 A). Można jednocześnie wybrać różne mikrosfery, a oprogramowanie może automatycznie śledzić je wszystkie klatka po klatce. W ten sposób komórki można podzielić na sekcje i niezależnie ocenić ruchliwość każdej z nich (Ryc. 6 A).
- Poprzez wybór mikrosfer znajdujących się na bocznych krawędziach obrazu komórki, można również niezależnie ocenić zmiany długości każdego segmentu oraz zmiany kąta jednego segmentu względem drugiego (wygięcie). (Ryc. 6B)
Rysunek 1. Schemat generatora EAEF oraz jego połączeń z systemem przechwytywania obrazu.
Rysunek 2. A) Zdjęcie układu eksperymentalnego. B) Detal stolika mikroskopu wraz z rysunkami przedstawiającymi elektrody i pojedynczą komórkę OHC umieszczoną pomiędzy nimi, z osią podłużną równolegle do pola elektrycznego.
Rycina 3. A) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do stymulacji jednoczęstotliwościowej. Wybrane parametry zaznaczono czerwonym okręgiem. B) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do seryjnej stymulacji jednoczęstotliwościowej. C) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do stymulacji liniowym sweepem. D) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do wielostymulacji.
Rysunek 4. Pojedyncza klatka OHC z dwoma punktami wybranymi odpowiednio u podstawy (zielony) i w wierzchołku (czerwony) komórki, przy użyciu funkcji „Feature tracking” oprogramowania ProAnalyst. Krzywa poniżej komórki przedstawia okresowe zmiany odległości między wybranymi punktami związane ze stymulacją elektryczną. Przesunięcie pionowego paska pozwala na wybór różnych klatek do indywidualnej analizy.
Rycina 5. Funkcja „Contour Tracking” w programie ProAnalyst wykrywa krawędź komórki i automatycznie mierzy pole powierzchni przekroju optycznego.
Rysunek 6. A) Przechwycony obraz odizolowanej komórki OHC znakowanej polistyrenowymi mikrosferami (góra) oraz ten sam obraz z pięcioma indywidualnie wybranymi mikrosferami (dół). Każdej mikrosferze przypisano inny kolor, a ich przemieszczenia mogą być śledzone klatka po klatce, analizowane i porównywane w sposób indywidualny i automatyczny. B) Segmenty o dowolnej długości mogą zostać zdefiniowane poprzez wybranie mikrosfer polistyrenowych znajdujących się na krawędziach komórki; zmiany długości tych segmentów, a także zmiany ich orientacji względem siebie (wyginanie komórki), mogą być automatycznie oceniane klatka po klatce za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
Film 1. Izolacja OHC świnki morskiej. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo
Film 2. Komórki włoskowate zewnętrzne (OHCs) ustawione równolegle i prostopadle do EAEF, wykazujące typową elektromobilność oraz reakcje zginania. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda eksperymentalna umożliwia szacowanie odpowiedzi motorycznych OHC w zakresie kHz bez żadnych ograniczeń ruchu komórki. Różne protokoły stymulacji, dodatkowe markery (mikrosfery), a także zmiany w orientacji komórki względem pola elektrycznego pozwalają na badanie nowych aspektów motylości OHC z poziomem szczegółowości, który był wcześniej nieosiągalny. Inne metody, np. te wykorzystujące fotodiody 9 lub laserową wibrometrię dopplerowską 10, wymagają ścisłej kontroli położeni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca wspierana przez granty National Institutes of Health R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Research Core oraz HEI. Jej treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne stanowisko NIH lub HEI. Autorzy deklarują brak istniejącego lub potencjalnego konfliktu interesów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Kolagenaza (typ 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL w L-15 |
Bibliografia
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
