Sekcja zwłok diagnostyczna oraz pobieranie wybranych tkanek i próbek u szczurów i myszy

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje procedury przeprowadzania podstawowego badania pośmiertnego myszy lub szczura oraz pobierania podstawowych organów, a także bardziej wymagających typów próbek do oceny histologicznej, mikrobiologicznej i PCR.

Streszczenie

Istnieje wiele typów próbek, które mogą być pobrane od zwierzęcia poddanego eutanazji, aby pomóc w diagnozowaniu lub odkrywaniu czynników zakaźnych w kolonii zwierząt. Prawidłowe pobranie tkanek do dalszej obróbki histologicznej może mieć wpływ na jakość wyników badań. W tym artykule opisano sposób przeprowadzania podstawowego badania ogólnego, w tym identyfikację serca, wątroby, płuc, nerek i śledziony, a także sposób pobierania tych narządów. Dodatkowo zademonstrowano cztery trudniejsze techniki pobierania tkanek/próbek. Pobranie i perfuzja płuc może być szczególnie trudne, ponieważ tkanka musi być odpowiednio napompowana utrwalaczem, aby wnętrze tkanki prawidłowo się utrwaliło i umożliwiło dokładną ocenę histologiczną. W tym artykule przedstawiono krok po kroku technikę usuwania płuca i napompowania go utrwalaczem w celu uzyskania optymalnego utrwalenia tkanki w ciągu 24 godzin. Pobieranie mózgu może być podobnie trudne, ponieważ tkanka jest miękka i łatwo ulega uszkodzeniu. W tym artykule przedstawiono krok po kroku technikę odsłaniania i usuwania mózgu z czaszki przy minimalnym uszkodzeniu tkanki. Węzeł chłonny krezkowy jest dobrym typem próbki, w której można wykryć wiele powszechnych czynników zakaźnych, ponieważ wirusy jelitowe utrzymują się dłużej w węźle chłonnym niż są wydalane z kałem. W tym artykule przedstawiono krok po kroku procedurę lokalizowania i aseptycznego usuwania węzła chłonnego krezki. Wreszcie, identyfikacja czynników zakaźnych dróg oddechowych może być przeprowadzona za pomocą posiewu bakterii lub testu PCR aspiratów płynu z nosa i/lub oskrzeli pobranych podczas sekcji zwłok. Procedura ta opisuje uzyskanie i przygotowanie próbki aspiratu oddechowego do hodowli bakteryjnej i testów PCR.

Protokół

1. Przygotowanie do sekcji zwłok

1. Ważnymi elementami każdego poważnego badania pośmiertnego (sekcja zwłok) są historia zwierzęcia i opis wyników.
2. Patolog weterynaryjny czytający slajdy histopatologiczne mógł nie widzieć zwierzęcia i polega na Tobie w kwestii podstawowych informacji.
3. Opisz dokładnie, co widzisz, zanim poddasz zwierzę eutanazji. Na przykład "mysz płci żeńskiej; jeden z pięciu w klatce; C57BL/6N; głowa przechylona w prawo" lub "brązowy samiec szczura; szczep nieznany; zwierzę się drapie; Na grzbiecie, w pobliżu ogona i głowy, występuje niejednolite wypadanie włosów".
4. Używaj jasnego, opisowego, obiektywnego języka. Modyfikatory, takie jak "łagodny", "umiarkowany" i "ciężki" mogą być przydatne, jeśli granice między poziomami są wyraźnie wyznaczone. Opisywanie rzeczy w kategoriach jedzenia lub przedmiotów gospodarstwa domowego generalnie nie jest zalecane.
5. Ważenie i mierzenie zwierząt, znalezisk lub narządów jest często przydatne. "Duża śledziona" dla ciebie może być normalną śledzioną dla innego obserwatora. Stwierdzenie, że śledziona ma wymiary 3 cm x 1,5 cm, dostarcza bardziej obiektywnych informacji.
6. Dokumentacja fotograficzna może być nieoceniona.
7. Należy przestrzegać wszystkich odpowiednich środków ochrony zdrowia i higieny pracy wymaganych do pracy z żywymi zwierzętami, potencjalnie zakaźnymi tuszami lub chemikaliami, takimi jak formalina.

2. Lokalizacja sekcji zwłok i badanie serca, płuc, wątroby, nerek i śledziony

1. Zgromadź niezbędne zapasy przed eutanazją zwierzęcia. Powinno to obejmować co najmniej deskę do rozwarstwiania lub podobną powierzchnię roboczą, kleszcze, nożyczki, etykiety na pojemniki, utrwalacz oraz wszelkie media lub probówki/kubki do zbierania, które mogą być potencjalnie potrzebne.
2. Krótko oceń stan, zachowanie i ruch zwierzęcia. Obserwuj i rejestruj wzorce oddychania (np. szybkie, płytkie), a także zdolność poruszania się i chód (np. utykanie, krążenie, drżenie).
3. Zwierzę należy poddać eutanazji zgodnie ze standardowymi procedurami obowiązującymi w Twojej placówce, zawsze przestrzegając wytycznych AVMA.
4. Oceń stan ciała zwierzęcia pod kątem nieprawidłowości skóry i sierści, wychudzenia lub odwodnienia. Zwróć uwagę na wszelkie sztuczne manipulacje, implanty lub blizny pooperacyjne.
5. Sprawdź wszystkie otwory zewnętrzne (uszy, oczy, nos, odbyt, otwory narządów płciowych i jamę ustną). W celu dokładniejszej obserwacji zaleca się użycie lunety sekcyjnej.
6. Ułóż uśpioną tuszę myszy lub szczura w pozycji grzbietowej na czystej desce rozwarstwiającej lub podobnej powierzchni roboczej.
7. Za pomocą nożyczek naciąć skórę na całej długości brzusznej od odbytu do podbródka, odbijając skórę i nacinając ścianę brzucha, odsłaniając wnętrzności brzuszne, ślinę i napletek/łechtaczkę oraz węzły chłonne szyjne i pachowe. Przetnij klatkę piersiową, aby odsłonić i zbadać wnętrzności klatki piersiowej, wykonując 2 nacięcia bocznie po każdej stronie klatki piersiowej, a następnie jedno w poprzek, w górnej części mostka, aby otworzyć przestrzeń wystarczająco szeroką, aby dokładnie zbadać wszystkie płaty płuc.
8. Zbadaj wygląd struktury mięśniowo-szkieletowej.
9. Oceń wszystkie narządy pod kątem nieprawidłowości. W szczególności znajdź i zidentyfikuj serce i płuca w klatce piersiowej. W szczególności znajdź i zidentyfikuj wątrobę, nerki i śledzionę w jamie brzusznej. Zwróć uwagę na wszelkie zmiany kolorów, różnice w rozmiarach oraz brakujące lub źle zlokalizowane narządy. Zwróć uwagę na konsystencję powierzchni, wszelkie dodatkowe tkanki (np. masy), kieszenie płynowe lub obecność płynu w jamach brzusznych/piersiowych.
10. Obserwuj przewód pokarmowy pod kątem zawartości lub jej braku, zwracając szczególną uwagę na pogrubione ściany, masy i/lub krwotok. Naciąć nerki (lewy przekrój podłużny, prawy przekrój poprzeczny, na linii środkowej, ale poza środkiem) skalpelem lub żyletką, aby sprawdzić, czy miąższ nie ma nieprawidłowości. Sprawdź krezkę pod kątem powiększonych węzłów chłonnych i/lub mas.
11. Zbadaj układ moczowo-płciowy, szukając zatorów, kieszonek płynowych, krwotoku lub innych nieprawidłowości.

3. Pośmiertne pobranie serca, wątroby, nerek i śledziony do histopatologii

1. Zebrać odpowiednio dobrane, oznakowane pojemniki wypełnione odpowiednią ilością 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF). Dostosuj ilość 10% NBF, aby uzyskać stosunek utrwalacza do tkanki 20:1.
2. Umieść tuszę myszy lub szczura w pozycji grzbietowej na czystej desce rozwarstwiającej lub podobnej powierzchni roboczej i odsłoń tkankę, która Cię interesuje.
3. Usuń tkankę z tuszy za pomocą kleszczy i nożyczek.
4. Tkanka powinna być dokładnie przycięta, aby usunąć tłuszcz i zbędną tkankę łączną. Tkanka powinna być czysta z krwi; Użyj zwykłej (lub fizjologicznej) soli fizjologicznej) do spłukania w razie potrzeby. Nigdy nie używaj wody destylowanej ani z kranu do płukania chusteczek.
5. Umieść chusteczkę w pojemniku 10% NBF.

4. Pośmiertne pobranie i perfuzja tkanki płucnej

1. Zbierz odpowiednio dobrane, oznakowane pojemniki wypełnione odpowiednią ilością 10% NBF. Dostosuj ilość 10% NBF, aby uzyskać stosunek utrwalacza do tkanki 20:1.
2. Umieść tuszę myszy lub szczura w pozycji leżącej grzbietowej na czystej desce rozwarstwiającej lub podobnej powierzchni roboczej.
3. Odsłoń tchawicę, serce i płuca.
4. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń skórę i mięśnie pokrywające brzuszne odcinki klatki piersiowej i szyjki macicy.
5. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń klatkę piersiową, odsłaniając serce i płuca, wykonując 2 nacięcia boczne z każdej strony klatki piersiowej, a następnie jedno w poprzek w pobliżu obojczyka, aby otworzyć przestrzeń wystarczająco szeroką, aby dokładnie zbadać wszystkie płaty płuc.
6. Odetnij mięśnie szyi rozciągające się od mostka i żeber do szczęki, w tym te leżące nad tchawicą.
7. Włóż nożyczki pod przednią krawędź klatki piersiowej i wykonaj 2 nacięcia, po jednym z każdej strony, aby usunąć część kości leżącą nad tchawicą.
8. Chwyć tchawicę w pobliżu szczęki kleszczami i całkowicie przetnij tchawicę nożyczkami umieszczonymi nad kleszczami
9. Delikatnie pociągnij tchawicę do góry za pomocą kleszczy, przecinając nożyczkami połączenia tkanek brzusznych, aż cały zestaw tkanek klatki piersiowej (tchawica, płuca i serce; czasami nazywa się to "wyrywaniem") zostanie usunięty z ciała.
10. Połóż płuca płasko na powierzchni roboczej.
11. Luźno zawiąż kawałek materiału do szycia lub sznurka kuchennego wokół tchawicy, uważając, aby nie pociągnąć mocno.
12. Napełnij strzykawkę utrwalaczem i przymocuj igłę, która jest wystarczająco mała, aby wejść do tchawicy. W przypadku myszy dobrze sprawdza się strzykawka o pojemności 1 ml lub 3 ml z igłą o rozmiarze 26. W przypadku szczurów dobrze sprawdza się strzykawka o pojemności 5 ml ze strzykawką o rozmiarze 18.
13. Włóż igłę do otworu tchawicy i za pomocą kleszczy przytrzymaj tchawicę otaczającą igłę. Zacznij powoli napełniać płuca utrwalaczem.
14. Napełnij płuca, aż do całkowitego napompowania. Nie przesadzaj ani nie niedopompuj. Ilość utrwalacza potrzebna do pełnego napełnienia płuc różni się w zależności od wieku, szczepu i stanu zdrowia zwierzęcia.
    1. Nadmierne napompowanie jest wykrywane przez wyciekanie płynu i pienienie się z tkanki płucnej.
    2. Niedociśnienie wykrywa się po tym, że płuca wydają się płaskie i nie są pełne we wszystkich obszarach.
15. Wyjąć igłę z tchawicy.
16. Zaciśnij materiał szwu lub sznurek otaczający tchawicę, aby zapobiec cofaniu się utrwalacza z płuc.
17. Umieść napompowane płuca w utrwalaczu, używając przybliżonego stosunku utrwalacza do tkanki wynoszącego 20:1.

5. Pośmiertne pobranie mózgu

1. Zbierz odpowiednio dobrane, oznakowane pojemniki wypełnione odpowiednią ilością 10% NBF. Dostosuj ilość 10% NBF, aby uzyskać stosunek utrwalacza do tkanki 20:1.
2. Umieść uświęconą zwłokę myszy lub szczura w pozycji leżącej brzusznej na czystej desce rozwarstwiającej lub podobnej powierzchni roboczej.
3. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń skórę i mięśnie pokrywające kalwarię.
4. Za pomocą nożyczek całkowicie usuń głowę z tuszy.
5. Za pomocą małych nożyczek włóż dolne ostrze do otworu wielkiego, otworu, w którym czaszka otwiera się do kanału kręgowego, i trzymając końcówki nożyczek skierowane do góry, zacznij ciąć bezpośrednio w górę i przez linię środkową kalwarii.
6. Za pomocą kleszczy odbij obie połówki kalwarii, odsłaniając mózg.
   1. Jeśli to możliwe, umieść odsłonięty mózg w utrwalaczu, gdy jest jeszcze w czaszce. Pozwoli to na ujędrnienie tkanki przed usunięciem z czaszki, jeśli jest to wymagane. Wielu patologów woli, aby sekcje były wycinane z mózgu, gdy są jeszcze w czaszce.
7. Delikatnie odwróć czaszkę, aby grawitacja pomogła tkance opaść z czaszki.
8. Używając zakrzywionych kleszczy, ostrożnie przesuń kleszcze wzdłuż zewnętrznej krawędzi mózgu i pod mózgiem, zaczynając od płatów węchowych, przesuwając się pod mózgiem i w kierunku móżdżku. Delikatnie uszczypnij kleszczami tkankę łączną lub nerwy, które powstrzymują mózg przed wypadnięciem z czaszki.
9. Umieść mózg w utrwalaczu, używając w przybliżeniu stosunku tkanki do utrwalacza 20:1.

6. Pośmiertne pobranie węzłów chłonnych krezkowych (MLN)

1. Pobieranie tkanek do analizy PCR powinno odbywać się przy użyciu techniki aseptycznej. Należy używać narzędzi sterylizowanych płomieniowo, autoklawowanych lub równoważnie sterylizowanych.
2. Zmontuj sterylne probówki Eppendorf oraz sterylne nożyczki i kleszczyki.
3. Umieść uświęconą tuszę myszy lub szczura w pozycji leżącej grzbietowej na czystej desce rozwarstwiającej lub podobnej powierzchni roboczej.
4. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek i kleszczy naciąć brzuszną ścianę brzucha od okolicy narządów płciowych do podstawy klatki piersiowej, usuwając zarówno skórę, jak i mięśnie oraz odsłaniając jelita.
5. MLN znajdują się w jamie brzusznej w tkance krezkowej wzdłuż okrężnicy, bezpośrednio przylegającej do jelita ślepego.
6. Aby zlokalizować MLN, najpierw zlokalizuj jelito ślepe, które jest dużą częścią jelita w kształcie przecinka. Okrężnica rozciąga się od jelita ślepego i często można ją zidentyfikować po obecności granulek kału. MLN znajdują się w krezce wzdłuż okrężnicy przylegającej do jelita ślepego. Można go zidentyfikować jako żółty, jajowaty lub kulisty mały grudka tkanki w białej tkance krezkowej i często jest nieco grubsza i twardsza w teksturze niż otaczająca krezka i tłuszcz. W razie potrzeby korzystaj z podręczników anatomii do orientacji.
7. Stosując technikę aseptyczną i sterylne narzędzia, usuń MLN i umieść w probówce Eppendorf oznaczonej informacjami identyfikującymi.

7. Pośmiertne pobranie aspiratu oddechowego

1. Zbierz potrzebne materiały - sterylną pipetę, sterylne nożyczki i kleszcze, sterylne roztwory do przepłukania przez drogi oddechowe oraz czystą deskę sekcyjną lub podobną powierzchnię roboczą.
2. Połóż uśpioną tuszę myszy lub szczura w pozycji leżącej grzbietowej na desce sekcyjnej.
3. W przypadku aspiratu oskrzelowego u szczurów uzyskać dostęp do dróg oddechowych przez tchawicę. W przypadku aspiracji do nosa u szczurów dostęp przez tchawicę lub przez ujście nosowo-gardłowe. W przypadku aspiracji oskrzelowych lub nosowych u myszy dostęp do dróg oddechowych przez przewód nosowo-gardłowy.
4. Jeśli potrzebne są zarówno aspiraty donoskowe, jak i oskrzelowe, należy najpierw wykonać aspirat oskrzelowy. Wykonaj aspirację do nosa za pomocą nowej sterylnej pipety.
5. Dostęp do tchawicy (metoda zalecana dla szczurów):
   1. Odbij skórę od obszaru szyjki macicy, aby odsłonić tkanki podskórne.
   2. Usuń gruczoły ślinowe i mięśnie szyjki macicy, aby odsłonić tchawicę.
   3. Za pomocą sterylnych narzędzi naciąć tchawicę, aby umożliwić dostęp do światła. Utrzymuj aseptykę przez cały czas zbierania (przejdź do kroku 7.7).
6. Dostęp do ujścia nosowo-gardłowego (aspirat do nosa i aspirat oskrzelowy, metoda zalecana dla myszy ze względu na mniejszy rozmiar tchawicy):
   1. Zabieg ten można wykonać zarówno w przypadku aspiratu donosowego, jak i oskrzelowego.
   2. Za pomocą narzędzi sterylizowanych płomieniowo lub autoklawowanych przeciąć staw skroniowo-żuchwowy (szczękowy) i odbić żuchwę od szczęki, odsłaniając ujście nosowo-gardłowe. Utrzymuj aseptykę przez cały czas zbierania (przejdź do kroku 7.7).
7. Pobrać około 1 ml płynu do pobierania próbek do sterylnej pipety. Może to być sól fizjologiczna, sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub bulion sojowy z tryptykazą. (Przejdź do kroku 7.8 lub 7.9, w zależności od tego, który aspirat zbierasz).
8. Aspirat oskrzelowy:
   1. Aseptyczne wprowadzenie pipety do światła tchawicy skierowane doogonowo i powolne wstrzykiwanie płynu do pobierania próbek do oskrzeli i płuc. Pobrać płyn do pobierania próbek z oskrzeli i płuc do pipety, a następnie wyjąć pipetę z tchawicy. Nie cały płyn powróci do pipety. Powtórz tę czynność, jeśli do badania potrzebna jest większa ilość płynu.
9. Aspirat do nosa:
   1. Aseptyczne wprowadzenie pipety do ujścia nosowo-gardłowego (myszy) lub światła tchawicy (szczury) skierowaną w stronę czaszki i powoli wstrzyknąć płyn do pobierania próbek do jamy nosowej.
   2. Upewnij się, że do jamy nosowej dociera się przez kontakt podniebienia nosowego z końcówką pipety lub przez obserwację płynu wtłaczanego do jamy, widocznego jako łąkotki tworzące się w otworze nosowym (nozdrzach) lub jako płyn widoczny przez półprzezroczyste podniebienie ustne. Nie należy widzieć płynu wydostającego się przez usta. Jeśli tak, zmień orientację pipety.
   3. Pobrać płyn do pobierania próbek z jamy nosowej do pipety i wyjąć pipetę z przewodu moczowego lub tchawicy.
10. Przeprowadzić próbkę w sposób aseptyczny do odpowiedniego podłoża lub pojemnika w celu przeprowadzenia testu.

8. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Narządy jamy brzusznej i klatki piersiowej u myszy. Narządy te są zazwyczaj widoczne, gdy zwierzę jest otwierane po raz pierwszy (żaden z narządów nie został przesunięty w celu odsłonięcia innych narządów również obecnych w jamie brzusznej). a) grasica, b) serce, c) płuca, d) przepona, e) wątroba, f) jelito cienkie, g) jelito ślepe, h) pęcherz moczowy.

Rysunek 2. Narządy jamy brzusznej i zaotrzewnowej u myszy. Jeśli jelita i wątroba zostaną podniesione i poruszone (lub usunięte), narządy te można zobaczyć. a) wątroba (w celach informacyjnych), b) jelita (w celach informacyjnych), c) żołądek, d) śledziona, e) nerki, f) okrężnica zstępująca, g) macica.

Rysunek 3. Męskie narządy rozrodcze. Mogą one być większe u większych, dojrzałych płciowo samców. a) pęcherzyki nasienne i gruczoły krzepliwe, b) jądra (wepchnięte do jamy brzusznej z moszny przez pierścienie pachwinowe, które pozostają otwarte u myszy i szczurów), c) pęcherz moczowy, d) gruczoły napletkowe, e) najądrza.

Rysunek 4. Żeńskie narządy rozrodcze. a) macica nieobciążająca (myszy i szczury mają macicę dwurożną), b) jajnik, zakopany w poduszce tłuszczowej jajnika, c) pęcherz moczowy, d) gruczoły łechtaczkowe (analogiczne do męskich gruczołów napletkowych).

Dyskusja

Zebranie danych na zakończenie badania może wymagać przeprowadzenia sekcji zwłok zwierząt. Opisz dobrze, co widać i pamiętaj o zbadaniu wszystkich tkanek. Procedury te mają na celu przede wszystkim optymalizację sekcji zwłok i pobierania próbek na potrzeby nadzoru nad chorobami zakaźnymi, ale większość z nich można łatwo dostosować do ukierunkowanych dochodzeń w sprawie podejrzewanych incydentów chorobowych lub wybuchów epidemii, w których być może zastosowany byłby tylko podzbiór procedur. Wiele procedur ma również z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Deska do krojenia	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Kot #36114
Małe nożyczki	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5910, G204	Ostrza 23 mm, długość 3,5 cala, proste
Średnie nożyczki	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6808, G207	5-calowe
duże nożyczki	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6826, G65 "	6,25"
Kleszcze z zakrzywionymi	narzędziami chirurgicznymi Roboz Co.	RS-8254 (M1/21004)	4,5", ząbkowany, lekko zakrzywiony
Kleszcze-Mikropreparatory	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5238	Hudson-(EWALD)
Kleszcze do tkanek	Roboz Surgical Instruments Co.	RS--8160
Sterylizator płomieniowy	szczura Oxford Labware	Bacti-Cinerator #5889-001007
	Skalpel Diagnostyka raka, Inc.	Skalpele na palec #60, Kat#FS0060
Pipety	VWR international	Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400
Worki do autoklawu	Propper Manufacturing Company	Torba sterylizatora Woreczki papierowe Cat#021002(3100923)E09110	Do pipet Pasteur
Żarówka do pipet	VWR international	Cat#56310-240
Probówki Eppendorf	Sarstedt Ltd	Probówka SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695
Probówki Eppendorf	Argos	5mL mikroprobówka Cat#T20765-C
Strzykawka	BD Biosciences	1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661
Igły	BD Biosciences	26G-309625 18G-305195
Neutralna buforowana formalina	VWR international	20L 10% NBF, Cat#16004-128
Saline	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Buforowany bank krwi soli fizjologicznej, Kat#23-309-178
Rosół sojowy z tryptykozy	BD Biosciences	TSB: Odwodniony, Kot#211825
Bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanem	Sigma-Aldrich	HA, Kat#P3813-10PAK
Kubki formalinowe	VWR international	4 uncje Kot#36318-852 8 uncji Kot#36318-860 16 uncji Kot#36318-858
Duże kubki formalinowe	Produkty	OakRidgePojemnik 32 uncje Kot#0432-1100
Bardzo duży kubek formalinowy	VWR international	HDPE Uniwersalny pojemnik 160 uncji Kot#89038-282
Materiał szwu	Henry Schein	Pleciony jedwabny szew chirurgiczny, nr ref#100-5000, M766750	Do inflacji płuc myszy
Zszywki	ze sznurka	Cat#QUA-46173	Do nadmuchiwania płuc szczura