$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Utwórz model myszy podobny do PCOS
UWAGA: Myszy użyte w tym badaniu miały mieszane tło (C57/B6, CD1, 129Sv) i były utrzymywane z jedzeniem i wodą ad libitum w cyklu 14/10 godzin światło/ciemność w temperaturze 24 °C.
- Przygotowanie granulatu DHT
- Autoklaw rurki silastyczne do sterylizacji. Wytnij rurki silastyczne na długość 15 mm za pomocą żyletki.
- Uszczelnij jedną stronę, wstrzykując silikonowy klej medyczny do probówki za pomocą igły o sile 20 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 3 ml. Tłok należy wyjąć ze strzykawki, a następnie wprowadzić klej do zbiornika. Tłok jest ponownie wkładany, a klej wciskany w dół, aż zacznie wychodzić z igły. igłę wykonuje się poprzez przecięcie ostrej końcówki igły 20 G dowolnymi mocnymi nożyczkami. Długość silikonu w tubie powinna być większa niż 2 mm, aby umożliwić przycinanie po produkcji.
- Suszyć przez noc; sprawdzić, czy po uszczelnionej stronie nie ma pęcherzyków powietrza. Te bez pęcherzyków powietrza są używane do granulek DHT. Inne mogą być używane do granulek kontrolnych bez DHT.
- Załóż rękawice, maskę, okulary i fartuch laboratoryjny przed zrobieniem granulatu DHT w kapturze, aby uniknąć narażenia na DHT na skórę.
- Wsypać proszek DHT do plastikowej łódki wagowej i wcisnąć otwartą stronę probówek z klejem (wyprodukowanych w 1.1.1) do proszku DHT.
- Proszek DHT można ubić za pomocą dużego spinacza do papieru, który jest wyprostowany. Kontynuuj, aż DHT osiągnie wysokość 4 mm (lub pożądaną długość). Sprawdź długość DHT linijką i uszczelnij otwartą stronę silikonem, wysusz przez noc.
- Przytnij każdą uszczelnioną stronę, aby uzyskać długość silikonu o długości 2 mm. Całkowita długość pelletu wyniesie 8 mm.
- Uszczelnij obie strony pustej rurki silastycznej jako pelety kontrolne (bez DHT).
- Przechowuj granulki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią (aby zapobiec ekspozycji na światło) w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Granulki DHT zachowują pełną skuteczność przez co najmniej 3 miesiące przechowywania.
- Wkładanie i wymiana DHT
- Do 20 granulek DHT lub granulek kontrolnych zanurza się oddzielnie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 30 ml sterylnej 0,9% soli fizjologicznej przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w celu zrównoważenia tuż przed włożeniem.
- Przed zabiegiem powierzchnie i rękawice są dezynfekowane za pomocą clidox, a powierzchnie robocze są pokrywane czystym papierem chłonnym z tworzywa sztucznego (podkładka chirurgiczna). Wszystkie narzędzia, które mają kontakt ze zwierzętami, są odkażane przed wejściem do obiektu dla zwierząt poprzez autoklawowanie. Narzędzia zostaną pozostawione do wyschnięcia i ostygnięcia przed użyciem.
- Wykorzystuje się 2-miesięczne samice myszy (4–5 myszy w klatce). Myszom wstrzykuje się dootrzewnowo ksylazynę (3,5 mg/kg masy ciała) i ketaminę (78,8 mg/kg masy ciała) za pomocą strzykawki insulinowej. Obliczenia dotyczące mieszania i dozowania znieczulenia znajdują się w Tabeli 1.
- Po uzyskaniu odpowiedniego znieczulenia, mierzonego utratą odruchu u nogi i spowolnionym oddechem, mysz zostanie przygotowana do operacji.
- Zdezynfekuj skórę obszaru za pomocą betadyny za pomocą sterylnej gazy i wyczyść 70% etanolem. Obszar zostanie ponownie pomalowany betadyną.
- Wytnij otwór o długości około 5 mm nożyczkami pod skórą w pobliżu szyi. Za pomocą trocharu 10 G wykonaj mały tunel (15 mm) w kierunku rostralnym. Osad jest wprowadzany grzbietowo z trocharem.
- Otwór jest następnie uszczelniany klejem chirurgicznym. Ręcznie przybliż krawędzie rany za pomocą kleszczy i delikatnych pociągnięć szczotką, aby nałożyć cienką warstwę płynnego kleju na przybliżone krawędzie rany. Nałóż 3 cienkie warstwy kleju, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kleju na ranie. Klej powinien sięgać 1 cm z każdej strony przylegających do siebie krawędzi rany. Do zamknięcia otworu można również użyć szwów lub klipsów chirurgicznych. Umieść myszy z powrotem w klatce, trzymanej pojedynczo, z poduszką grzewczą w celu odzyskania sprawności. Wymieniaj granulki co 4 tygodnie, aby utrzymać stały poziom ekspozycji na androgeny. Oryginalny granulek zostanie usunięty, a nowy pellet zostanie włożony zgodnie z powyższym opisem, w podobnej pozycji.
| Ketamina
(100 mg/ml)
| Ksylazyna
(100 mg/ml)
| słony
(0,9 %)
|
| 175 μL | 15 μL | 810 μL |
| Dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu roboczego: 0,1 ml/20 g masy ciała |
Tabela 1. Koktajl ketamina/ksylazyna.