$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Podstawowa obudowa myszy
- Umieść myszy w plastikowych klatkach z solidnym dnem i bokami oraz warstwą miękkiej ściółki i materiału do gniazdowania, takiego jak rozdrabnianie papieru. Używaj ściółki składającej się z rozdrobnionych kolb kukurydzy lub wiórów drzewnych i upewnij się, że ściółka jest regularnie zmieniana ze względów sanitarnych.
- Zapewnij dostęp do żywności i wody ad libitum. W górnej części plastikowej klatki znajduje się pojemnik na żywność. Dozuj odpowiednio sformułowane granulki pokarmu dla myszy z zasobnika na żywność i zapewnij dozownik wody. Upewnij się, że górna część klatki jest wyposażona w filtr powietrza, który chroni myszy przed zanieczyszczeniami zewnętrznymi.
- Utrzymuj naturalny rytm okołodobowy myszy, przestrzegając 12-godzinnego cyklu światła i ciemności w obiekcie inwentarskim. Przeprowadzaj testy behawioralne o tej samej porze dnia, najlepiej podczas ciemnego cyklu zwierzęcia, na przykład w godzinach wieczornych.
nuta: Należy zwrócić uwagę na rozróżnienie myszy w obudowie. Dostępne są różne metody rozróżniania myszy, takie jak dziurki w uszy, kolczyki i oznaczenia na ogonie.
2. Testowanie labiryntu Barnes: Budowa
- Zdobądź okrągłą drewnianą deskę o średnicy 120 cm.
- Wytnij 20 okrągłych otworów (o średnicy 4,5 cm) na obwodzie koła. Umieść każdy otwór tak, aby znajdował się w odległości 2.5 cm od krawędzi labiryntu i 13 cm od sąsiednich otworów.
- Wygładź powierzchnie i pomaluj je na błyszczący biały kolor (zalecany jest jasny kolor).
- Wyznacz jedną stronę planszy labiryntu do włożenia małych haczyków na kubki w odległości około 2–3 cm od każdego z 20 otworów i umieść dwa haczyki na każdy otwór (po jednym z każdej strony każdego otworu).
- Użyj płytkich czarnych (plastikowych) krążków do zakrycia otworów z boku labiryntu haczykami. Użyj haczyków, aby przymocować grube gumki, aby przytrzymać krążki na dnie labiryntu.
- Bezpiecznie zamontuj labirynt Barnes 120 cm nad ziemią, z dala od innych podobnie wysokich obiektów, takich jak stoły czy krzesła. Pudełko lub stołek może być użyty do podparcia środka labiryntu.
- Umieść duże białe plakaty z jednym kształtem na każdej ścianie (trójkąt, koło i krzyż) jako dodatkowe wskazówki labiryntu po 3 stronach labiryntu. Utrzymuj plakaty na ścianach wokół labiryntu dla każdej próby.
- Po ostatniej stronie labiryntu ustaw solidną czarną kurtynę, aby ukryć obserwatorów, aby dane mogły być rejestrowane dokładnie, bez widoczności badaczy dla myszy w labiryncie.
- Zawieś kamerę wideo nad areną, aby zobaczyć z lotu ptaka całą powierzchnię labiryntu.
- Oczyść każdą powierzchnię labiryntu (w tym czarne dyski i pudełko na tarczę) wodą, a następnie 70% roztworem etanolu przed i po każdej próbie na myszy.
- Umieść źródło światła o mocy 100 W w odległości 25 cm od środka labiryntu (włącz/wyłącz na początku/na końcu próby) i upewnij się, że dyski i haki są skierowane do podłogi.
nuta: Wszystkie inne światła górne w pomieszczeniu powinny być wyłączone podczas testowania. Zaleca się dodanie ultradźwiękowego generatora hałasu zawieszonego obok światła o mocy 100 W. Włącz/wyłącz ją na początku/na końcu każdej próby.
3. Testowanie labiryntu Barnesa: Procedura
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie elementy labiryntu są czyszczone wodą i 70% roztworem etanolu przed i po każdej próbie, dając czas na całkowite wyschnięcie przed wznowieniem testów. Upewnij się, że masz przygotowane środki czyszczące, a także liczniki czasu na próby.
- Trzymaj wszystkie myszy w grupach, korzystając z niezawodnej metody identyfikacji. Trzymaj myszy poza pomieszczeniem testowym, gdy nie biegają aktywnie po labiryncie. Ma to na celu zapewnienie, że nie zostaną one przedwcześnie poddane działaniu ultradźwiękowej wytwornicy hałasu.
- Z myszami należy się obchodzić, delikatnie podnosząc je i trzymając od nasady ogona, trzymając łapy na dłoni.
- W celu treningu niech myszy biegają po labiryncie codziennie raz dziennie przez 7 dni z rzędu, aby ocenić uczenie się/przyswajanie.
nuta: Pojedyncze długoterminowe badanie można przeprowadzić w późniejszym terminie, aby ocenić pamięć/zapamiętywanie. Obecny protokół szkolił dorastające myszy począwszy od 32 dnia po urodzeniu, a długoterminowe badanie przeprowadzono u dorosłych w wieku 4 miesięcy.
- Losowo przypisz każdą mysz do docelowego otworu, z którego będzie korzystać przez cały okres testowy. Otwory mogą być oznaczone jako 1–20 na spodzie labiryntu lub na zewnątrz obwodu labiryntu, gdzie nie są widoczne dla myszy w labiryncie.
- Zastąp przypisany dysk z otworem małym czarnym pudełkiem (23 x 11 cm). Mocno przymocuj go do labiryntu Barnesa za pomocą gumek recepturek połączonych z najbliższymi haczykami.
nuta: Pole docelowe jest na tyle płytkie, że mysz może łatwo do niego wejść, lub zawiera stopień, aby mysz nie musiała do niego wskakiwać.
- Umieść mysz na środku labiryntu pod kubkiem, aby zaaklimatyzować się przez 30 sekund, aż rozpocznie się test. Rozpocznij nagrywanie wideo.
- Włącz świetlisty i ultradźwiękowy generator hałasu. Podnieś kubek za pomocą mechanizmu sznurkowego, aby uniknąć odchylenia początkowego kierunku zwierzęcia. Uruchom minutnik i usiądź za kurtyną, aby obserwować.
- Po wejściu myszy do otworu docelowego zakryj otwór tym samym nieprzezroczystym kubkiem, który był używany na początku próby lub segregatorem i wyłącz ultradźwiękowy generator dźwięków. Jeśli mysz nie weszła do celu po upływie 5 minut, zagnij mysz do otworu docelowego.
- Upewnij się, że mysz wchodzi do otworu. Gdy mysz znajdzie się w polu docelowym, zakryj otwór i wyłącz terkotkę. Pozwól myszy pozostać w polu docelowym przez 1 minutę bez zakłóceń.
- Chociaż otwór docelowy pozostanie stały dla każdej myszy przez cały okres treningu, każdego dnia uruchamiaj myszy w losowej kolejności, aby upewnić się, że nie podążają za żadnymi wskazówkami/zapachami pozostawionymi przez poprzednią mysz.