Przygotowanie organoidów z guzów: model guza 3D in vitro

Opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Departamencie Laboratoryjnych Zasobów Zwierzęcych, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, Nowy Jork.

UWAGA: Samce myszy, które mają być poddane sekcji w celu wyizolowania prostaty lub guzów prostaty w celu wytworzenia organoidów, powinny osiągnąć co najmniej wiek dojrzałości płciowej — około 8-10 tygodnia życia. Konkretny wiek myszy może się różnić w zależności od badania. Niektóre czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze wieku, obejmują zależne od wieku zmiany w populacjach komórek prostaty, zależną od wieku ekspresję określonych transgenów Cre napędzanych przez promotor oraz szybkość progresji guza prostaty w określonym GEMM.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia obrazkowy opis procedury generowania organoidów nowotworowych.

1. Przygotowanie

1. Przygotuj pożywkę organoidową dla prostaty myszy zgodnie z Drostem i wsp. z następującymi zmianami. Użyj kondycjonowanej pożywki zamiast rekombinowanych białek dla Noggin i R-Spondin i użyj końcowego stężenia 1% (v/v) zamiast 10%, zarówno dla pożywki kondycjonowanej Noggin, jak i R-Spondin.
   UWAGA: Komórki HEK293 stabilnie transfekowane HA-mysim Noggin-Fc lub HA-mysim Rspo1-Fc są używane odpowiednio do produkcji pożywki kondycjonowanej Noggin- lub R-spondyną. Te linie komórkowe były darem od Laboratorium Calvina Kuo na Uniwersytecie Stanforda.
2. Przygotować roztwór wytrawiający w probówce o pojemności 15 ml, rozcieńczając 20 mg/ml kolagenazy II z pożywką Advanced DMEM/F12(+++) do końcowego stężenia 5 mg/ml. Dodać inhibitor skał Y-27632 do roztworu kolagenazy II w końcowym stężeniu 10 μM.
   UWAGA: Stosunek buforu trawiennego do tkanki wynosi od 1 ml do 50 mg, którego używamy zgodnie z Drostem i wsp.

2. Mielenie i trawienie tkanki nowotworowej

1. W kapturze do hodowli komórkowej umieść tkankę guza gruczołu krokowego w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm, wypreparuj i odrzuć tkankę martwiczą.
2. Zmiel pozostałą tkankę guza prostaty w kostkę o wielkości 1 mm³, przytrzymując kawałki tkanki sterylnymi zakrzywionymi kleszczami i tnąc nożyczkami do wypreparowania.
3. Umieść zmielone kawałki guza w probówce o pojemności 15 ml z buforem do wytrawiania, nabierając je zakrzywioną stroną kleszczy. Trawić tkankę nowotworową w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez 1,5 do 2 godzin. Sprawdzaj postęp trawienia co 20 min.
   UWAGA: W tym czasie wyjąć co najmniej 2 ml matrycy z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie. Rozmrożenie 1 ml podwielokrotności matrycy zajmie około 3 godzin.
4. Po wytrawieniu tkanek odwirować probówkę o sile 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby utworzyć osad komórkowy.
5. Usuń supernatant, przesuń probówkę, aby poluzować osad komórkowy i ponownie zawieś osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanej trypsyny uzupełnionej 10 μM Y-27632 Rock Inhibitor. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut.
6. Po inkubacji pipetować w górę i w dół 5 razy za pomocą standardowej końcówki P1000. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na kolejne 5 minut i powtórzyć krok 2.6.
   UWAGA: Na tym etapie procedury należy ogrzać sterylne 6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych, umieszczając je w inkubatorze o temperaturze 55 °C.

3. Liczenie komórek i ponowne zawieszenie w matrycy

1. Przemyć komórki, dodając 9 ml zimnego AdDMEM/F12 (+++) i odwirować probówkę o sile 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
2. Po odwirowaniu usunąć supernatant, przesunąć probówkę, aby poluzować osad i ponownie umyć komórki, dodając 10 ml zimnego AdDMEM/F12 (+++). Odwirować probówkę o sile 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
3. Po odwirowaniu usunąć supernatant, przesunąć probówkę, aby poluzować osad, ponownie zawiesić komórki w 1 ml AdDMEM/F12 (+++) i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru zgodnie ze standardową procedurą.
4. Siedem do ośmiu kopuł mieści się w jednej studzience 6-dołkowej, gdy organoidy są siane w matrycy w sposób kroplowy. Około 200 μl matrycy pozwoli na wyprodukowanie 7-8 kopuł. Zdecyduj, ile studzienek organoidów jest potrzebnych do przyszłych celów eksperymentalnych i oblicz wymaganą objętość matrycy. Następnie oblicz objętość roztworu zawierającego komórkę potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 1,0 x 10⁶ komórek/ml matrycy.
5. Po zliczeniu komórek odwirować przy 175 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, przesunąć probówkę, aby poluzować osad i ponownie zawiesić komórki w objętości matrycy obliczonej w kroku 3.4.
   UWAGA: Matryca pozostaje w postaci ciekłej tylko w temperaturze 4 °C; Probówki podstawowe Matrix i roztwory Matrix-Cell należy zawsze trzymać na lodzie.

4. Kopuły matrycowe do powlekania i zastosowanie mediów

1. Wymieszaj roztwór komórki matrycowej z pipetą P200, aby równomiernie rozprowadzić komórki bez wprowadzania pęcherzyków. Wyjąć 6-dołkową naczynie do hodowli z inkubatora o temperaturze 55 °C.
2. Ostrożnie odpipetuj 200 μl roztworu z matrycą i szybko wrzuć roztwór do studzienki, aby utworzyć kopuły.
3. Powtarzać krok 4.2. aż do wyczerpania objętości roztworu komórki matrycowej. Pozwól kopułom zestalić się w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
4. Odwróć 6-dołkową szalkę do góry nogami i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby kontynuować krzepnięcie przez 20 minut.
5. Po inkubacji dodaj 2 ml pożywki z organoidów prostaty myszy do każdej studzienki. Dodać syntetyczny androgen R1881 do każdej studzienki dla końcowego stężenia 1 nM i inhibitora skał Y-27632 do końcowego stężenia 10 μM. Dokładnie wymieszać i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C do hodowli.
   UWAGA: Pożywki do hodowli organoidów należy suplementować inhibitorem skał 10 μM Y-27632 tylko przez 1 tydzień po wytworzeniu organoidów.

Rycina 1: Schemat blokowy protokołu generowania organoidów guza prostaty. Po wycięciu guza prostaty zmiel tkankę na kawałki o średnicy 1 mm. Trawić kawałki guza w kolagenazie, zbierać komórki i trawić w trypsynę, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Po zliczeniu komórek ponownie zawiesić objętość matrycy wymaganą do stężenia komórek 1,0 x 106 komórek/ml. Talerz kopuły w naczyniu metodą kropli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.