$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące zarodków jaj kurzych zostały sprawdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie jajek
- Przed otrzymaniem jaj zmontuj i wyrównaj inkubator do jaj do 37.8 °C (100 °F) przy wilgotności 60-70% zgodnie z instrukcjami producenta.
nuta: Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, do kontrolowania wilgotności można używać wody w autoklawie.
- Po otrzymaniu zapłodnionych jaj kurzych Rhode Island Red od certyfikowanego dostawcy jaj klasy laboratoryjnej, wytrzyj na sucho powierzchnię skorupek ręcznikami papierowymi. Do usunięcia przyklejonego materiału można użyć lekko zwilżonego ręcznika papierowego. Suszyć natychmiast.
nuta: Zwilżenie skorupki płynem o temperaturze poniżej 43,3 °C może wprowadzić bakterie do jaja. Jeśli ktoś zdecyduje się umyć lub zdezynfekować jajka, temperatura płynu musi wynosić od 43,3 do 48,9 °C. Wyższe temperatury mogą ugotować jajka. Wybór środka dezynfekującego powinien być dokonany na podstawie mikroorganizmów budzących obawy.
- Użyj ołówka lub markera, aby oznaczyć datę na jajku. Jest to traktowany jako dzień rozwoju 0.
- Umieścić jaja w inkubatorze do jaj i inkubować przez co najmniej 7 dni z rotacją, aby umożliwić rozwój CAM. Można użyć automatycznego rotatora lub jaj można obracać o 180° 2-3 razy dziennie.
2. Otwieranie jaj
UWAGA: Otwieranie jaj powinno nastąpić, gdy CAM jest już w pełni rozwinięty. Zazwyczaj ma to miejsce w 7 lub 8 dniu programowania.
- Zdezynfekuj komorę bezpieczeństwa biologicznego za pomocą 70% etanolu. Podobnie zdezynfekuj i umieść w szafie bezpieczeństwa biologicznego stojak na jajka, świecznik do jajek, marker, akumulatorowe narzędzie obrotowe z kamieniem szlifierskim z węglika krzemu i okrągłą tarczą tnącą, igłę 18 G, kontroler pipet z ćwierćcalową rurką próżniową, taśmę pakową, nożyczki biurowe, zakrzywione nożyczki, kleszcze Semken (lub podobne), waciki i przezroczysty opatrunek foliowy o wymiarach 6 x 7 cm. Jeśli to możliwe, używaj narzędzi sterylnych, jednorazowych lub autoklawowanych.
- Wyłącz rotator jaj. Umieść około 1-3 jaj w szafie bezpieczeństwa biologicznego na stojaku na jajka. W ciemności przyłóż świecę do jajka przy skorupce jajka, aby zidentyfikować komórkę powietrzną. Zaznacz położenie komory powietrznej.
nuta: Intensywność oświetlenia z świecy do jajek ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji wnętrza jajka. Jeśli komórka powietrzna lub układ naczyniowy są stale trudne do zobaczenia, spróbuj wymienić baterie świecy do jajek.
- Przesuń świecę do jajek po skorupce, aby znaleźć dużą sieć naczyń krwionośnych. W razie potrzeby obróć jajko. Idealne unaczynienie będzie rozgałęziać się w pobliżu środka jaja. Użyj markera, aby narysować naczynia krwionośne, które mają być użyte do implantacji.
- Włącz światło w masce. Za pomocą akumulatorowego narzędzia obrotowego wyposażonego w kamień szlifierski z węglika krzemu wywierć mały otwór w skorupie bezpośrednio nad środkiem komory powietrznej. Wiercić, aż większość skorupy zostanie usunięta, ale biała, wewnętrzna membrana jest nienaruszona.
nuta: Wiercenie nad komórką powietrzną przed skierowaniem na układ naczyniowy pozwala określić grubość tej konkretnej skorupki jaja nad komórką powietrzną, a nie nad CAM i naczyniem. Jeśli CAM lub unaczynienie zostanie zakłócone, komórka jajowa nie nadaje się do implantacji.
- Wywierć i otwórz kolejny mały otwór, w którym okno naczyniowe zostanie otwarte, tak jak to zostało zrobione w przypadku komórki powietrznej (krok 2.4).
- Za pomocą igły 18 G delikatnie przebić przez białą, wewnętrzną błonę nad komórką powietrzną i naczyniami krwionośnymi. Jeśli nie możesz przebić skorupy, ostrożnie wywierć trochę więcej. Upewnij się, że biała, wewnętrzna membrana (ale nie CAM) jest uszkodzona na całym wierconym obszarze. Demontaż elementu membrany nie jest konieczny.
nuta: Jeśli CAM lub układ krwionośny zostanie zakłócony na tym etapie, wyrzuć jajo. Uszkodzenie jest widoczne, jeśli z wywierconego otworu wycieka krew lub albumina.
- Wyłącz oświetlenie maski. Za pomocą świecy do jaj sprawdź, czy komórka powietrzna została przeniesiona z końca jajka do obszaru nad naczyniami krwionośnymi. W razie potrzeby umieść rurkę próżniową włożoną do kontrolera pipet wokół otworu nad oryginalną komórką powietrzną i delikatnie zasysaj krótkimi seriami, aby przesunąć komórkę powietrzną.
- Użyj markera, aby obrysować nowe położenie komórki powietrznej około 0.5 cm wewnątrz granicy air-CAM. Przymocuj kawałek taśmy pakowej tuż nad nową komorą powietrzną. W razie potrzeby użyj standardowych nożyczek biurowych, aby przyciąć taśmę do odpowiedniego rozmiaru.
nuta: Taśma może zakłócać przepływ powietrza przez powłokę i nie powinna być większa niż jest to konieczne, aby w pełni zakryć komórkę powietrzną.
- Włóż jaja z powrotem do inkubatora, aby się ogrzały bez obracania, z nową komorą powietrzną skierowaną do góry. Powtórz kroki 2.2-2.9 dla pozostałych jaj, które mają zostać otwarte.
nuta: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. W przypadku braku pewności co do jakości rozwoju CAM, niewielka liczba jaj powinna przejść przez krok 2.16 przed otwarciem pozostałych jaj.
- Umieść około 1-3 jaj z przeniesionymi komórkami powietrznymi na stojaku na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
nuta: Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do przedostania się zanieczyszczenia do otwartego jaja. Dlatego zawsze otwieraj jaja w komorze bezpieczeństwa biologicznego i używaj sterylnych narzędzi i sprzętu, gdy tylko jest to możliwe.
- Za pomocą akumulatorowego narzędzia obrotowego wyposażonego w okrągłą tarczę tnącą wytnij małą linię nad granicą komórki powietrznej narysowaną w kroku 2.8. Upewnij się, że znajduje się on około 0.5 cm wewnątrz rzeczywistej granicy powietrze-CAM, aby uniknąć zakłócenia CAM lub układu krwionośnego. Przeciąć całkowicie skorupę, ale uważaj, aby nie wniknąć wystarczająco głęboko, aby zakłócić CAM lub układ krwionośny.
- Za pomocą zakrzywionych nożyczek przetnij pozostałą komórkę powietrzną, aby utworzyć okno w skorupie.
nuta: Jeśli na usuniętej skorupce znajduje się krew lub błona, oznacza to, że jajo nie nadaje się do implantacji. Jeśli duża część jaj nie zostanie czysto otwarta, należy rozważyć odczekanie co najmniej 1 dodatkowego dnia na otwarcie pozostałych jaj, aby umożliwić lepsze tworzenie się CAM. Jeżeli skorupki pozostałych jaj nie zostały przekłute, należy wznowić obracanie jaj w inkubatorze.
- Sprawdź żywotność zarodka. Zdolne do życia zarodki będą wykazywać rozległe unaczynienie, czystą albuminę, ruchy zarodka lub widoczne bicie serca.
- Za pomocą kleszczyków Semken wyciągnij małe kawałki bawełny ze sterylnego wacika. Delikatnie osusz powierzchnię CAM, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia z powłoki.
nuta: Usunięcie zanieczyszczeń musi być przeprowadzone w tym samym dniu, w którym jaja są otwarte.
- Przykryj otwór muszli jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 x 7 cm.
- Włóż jaja z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że jajko jest bezpiecznie osadzone z otwartym oknem skierowanym do góry, a CAM nie dotyka przezroczystego opatrunku foliowego. Użyj kawałka stojaka na jajka, krawędzi rotatora do jaj lub innego odpowiedniego przedmiotu, aby podeprzeć jajka, które się toczą.
- Powtórz kroki 2.10-2.16 dla wszystkich pozostałych jaj, które mają zostać otwarte.
nuta: Otwieranie komórek jajowych nie musi być zakończone w tym samym dniu co implantacja. Odczekanie co najmniej 1 dnia może pomóc w wyeliminowaniu jaj, których żywotność została zagrożona przez otwarcie skorupki.