Test wirowania agarozy: technika osadzania organoidów do analizy histologicznej

Streszczenie

Źródło: Lee, S. et al. Tworzenie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie przeprowadzamy test spin-down, aby osadzić organoidy 3D raka prostaty w agarozie. Te osadzone organoidy mogą być wykorzystane do dalszej analizy histopatologicznej w celu zbadania wzrostu i rozwoju raka.

Protokół

1. Przetwarzanie organoidów w histologii: metoda Agarozy Spin Down

UWAGA: Ten protokół jest adaptacją poprzedniej publikacji Vlachogiannisa i wsp. Dodaliśmy krok polegający na osadzaniu agarozy, aby pomyślnie osadzić wszystkie populacje organoidów.

1. Usuń istniejące media ze studni. Uważaj, aby nie zasysać kopuł membrany podstawnej.
2. Dodać równą (równą objętości pożywki usuniętej z kroku 1) objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
3. Usuń kopułę membrany podstawnej za pomocą pipety i zmiażdż kopułę membrany podstawnej za pomocą końcówki pipety. Zebrać zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek w probówce o pojemności 1,5 ml.
4. Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
5. Usunąć supernatant (roztwór do odzyskiwania komórek). Zachować wszystkie supernatanty w oddzielnych probówkach do końca, kiedy obecność organoidów zostanie potwierdzona w końcowym etapie granulowania.
6. Dodać żądaną objętość (Tabela 1) zimnego PBS i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby mechanicznie zakłócić osad.
7. Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
8. Usunąć supernatant (PBS).
9. Utrwalić osad w dopasowanej objętości (np. 500 μl na jeden osad z 24-dołkowej kultury na płytce, tabela 1) 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
10. Po utrwaleniu odwirować przy ciśnieniu 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
11. Usunąć supernatant (PFA).
12. Przemyć dopasowaną objętością (np. 500 μl dla jednego osadu z 24-dołkowej hodowli na płytce, tabela 1) PBS i odwirować przy 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
13. Przygotuj ciepłą agarozę (2% agarozy w PBS).
    nuta: W tym przypadku granulki komórkowe do zamrożonych skrawków mogą być bezpośrednio zawieszone w 200 μl związku OCT.
14. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl agarozy (2% w PBS).
    1. Natychmiast po dodaniu agarozy delikatnie oderwać osad komórkowy od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. Jak pokazano na rysunku 1, jeśli osad komórkowy nie jest fizycznie odłączony od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml, istnieje ryzyko utraty całości lub części osadu komórkowego podczas procesu zatapiania agarozy.
15. Poczekaj, aż 2% agaroza w PBS całkowicie się zestali.
16. Odłączyć zestalony blok agarozy od probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
17. Przenieść odłączony blok agarozy zawierający osad komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
18. Napełnij probówkę 70% EtOH i kontynuuj, stosując konwencjonalny protokół odwadniania tkanek i zatapiania parafiny.

Tabela 1: Gęstość wysiewu, objętość membrany podstawnej i objętość podłoża potrzebna dla jednej kopuły

szt. szt. szt.

Talerz kulturowy	Gęstość wysiewu (komórki)	Objętość membrany podstawnej (μl)	Średni (μL)
48 studnia	25 000-50 000	20	Z kolei 250
24 studnia	50 000-250 000	Rozdział 40	500
6 studni	50 000-250 000	Rozdział 40	2 000

Wyniki

Rysunek 1: Kluczowy krok do udanego osadzania agarozy. Proces polegający na odłączaniu osadu komórkowego od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 ml Pipettmana	Gilson	F123602
Strzykawka 1 ml	Strzykawka BD	329654
Probówka 1,5 ml	Produkty Spectrum Lab	941-11326-ATP083
Igła 25G	Igła BD PrecisionGlide	305122
4% paraformaldehydu (PFA)	Alfa Aesar	Zobacz materiał J61899
70% etanol (EtOH)	Firma VWR	BDH1164-4LP
Agarozy	Lonza	50000
Płytka do hodowli komórkowych - 24 dołki	Costar	3524
Płytka do hodowli komórkowych - 48 dołków	Costar	3548
Płytka do hodowli komórkowych - 6 dołków	Costar	Numer katalogowy: 3516
Roztwór do dysocjacji komórek, Accumax	Innowacyjne technologie komórkowe, Inc.	Zobacz materiał AM105
Rozwiązanie do odzyskiwania komórek	Corning	354253
Skrobak do komórek	Sarstedt	83,18
dPBS (pałeczka dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
Końcówki do pipet o pojemności 1 ml (niebieskie końcówki)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Mała wirówka stołowa	ThermoFisher Naukowy	75002426
Związek OCT	Tka tkankowa	Numer katalogowy: 4583
Kąpiel wodna	Fisher Sc	2320

szt. TGL SZT. powiedział: pkt. szt.