Test wirowania agarozy: technika osadzania organoidów do analizy histologicznej

1. Przetwarzanie organoidów w histologii: metoda Agarozy Spin Down

UWAGA: Ten protokół jest adaptacją poprzedniej publikacji Vlachogiannisa i wsp. Dodaliśmy krok polegający na osadzaniu agarozy, aby pomyślnie osadzić wszystkie populacje organoidów.

1. Usuń istniejące media ze studni. Uważaj, aby nie zasysać kopuł membrany podstawnej.
2. Dodać równą (równą objętości pożywki usuniętej z kroku 1) objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
3. Usuń kopułę membrany podstawnej za pomocą pipety i zmiażdż kopułę membrany podstawnej za pomocą końcówki pipety. Zebrać zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek w probówce o pojemności 1,5 ml.
4. Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
5. Usunąć supernatant (roztwór do odzyskiwania komórek). Zachować wszystkie supernatanty w oddzielnych probówkach do końca, kiedy obecność organoidów zostanie potwierdzona w końcowym etapie granulowania.
6. Dodać żądaną objętość (Tabela 1) zimnego PBS i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby mechanicznie zakłócić osad.
7. Wirować w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
8. Usunąć supernatant (PBS).
9. Utrwalić osad w dopasowanej objętości (np. 500 μl na jeden osad z 24-dołkowej kultury na płytce, tabela 1) 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
10. Po utrwaleniu odwirować przy ciśnieniu 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
11. Usunąć supernatant (PFA).
12. Przemyć dopasowaną objętością (np. 500 μl dla jednego osadu z 24-dołkowej hodowli na płytce, tabela 1) PBS i odwirować przy 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
13. Przygotuj ciepłą agarozę (2% agarozy w PBS).
    nuta: W tym przypadku granulki komórkowe do zamrożonych skrawków mogą być bezpośrednio zawieszone w 200 μl związku OCT.
14. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl agarozy (2% w PBS).
    1. Natychmiast po dodaniu agarozy delikatnie oderwać osad komórkowy od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. Jak pokazano na rysunku 1, jeśli osad komórkowy nie jest fizycznie odłączony od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml, istnieje ryzyko utraty całości lub części osadu komórkowego podczas procesu zatapiania agarozy.
15. Poczekaj, aż 2% agaroza w PBS całkowicie się zestali.
16. Odłączyć zestalony blok agarozy od probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
17. Przenieść odłączony blok agarozy zawierający osad komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
18. Napełnij probówkę 70% EtOH i kontynuuj, stosując konwencjonalny protokół odwadniania tkanek i zatapiania parafiny.

Tabela 1: Gęstość wysiewu, objętość membrany podstawnej i objętość podłoża potrzebna dla jednej kopuły

Rysunek 1: Kluczowy krok do udanego osadzania agarozy. Proces polegający na odłączaniu osadu komórkowego od ścianki probówki o pojemności 1,5 ml.