Ekstrakcja lizatu białkowego: technika lizy organoidów w celu zbierania białek komórkowych

Streszczenie

Źródło: Crowell, P. D. et al. Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie pokazujemy ekstrakcję lizatów białkowych z organoidów prostaty hodowanych w pierścieniu macierzy błony podstawnej. Analiza wyekstrahowanych frakcji białkowych może pomóc w badaniu ekspresji markerów rodowych w organoidach.

Protokół

1. Ekstrakcja lizatu białkowego z organoidów prostaty do analizy Western Blot — CZAS: 2.5-4 H

UWAGA: Przed pobraniem organoidów do ekstrakcji lizatu białkowego, przygotuj i wstępnie podgrzej pożywkę zawierającą dispazę (Tabela 1).

1. Usuń pożywkę z każdej studzienki, przechylając 24-dołkową płytkę pod kątem 45° i delikatnie usuwając istniejące media ze środka każdej studzienki za pomocą pipety P1000, unikając pierścienia żelowego matrycy.
2. Aby zebrać organoidy, należy kilkakrotnie przedmuchać żel matrycowy, pipetując 1 ml pożywki zawierającej dyspazę bezpośrednio na pierścień żelowy matrycy, aż cały pierścień zostanie usunięty, a następnie przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać bezpośredniego kontaktu ze studzienkami pokrytymi poli-HEMA. Bezpośredni kontakt może spowodować zanieczyszczenie pobranego materiału preparatem Poly-HEMA, co może negatywnie wpłynąć na przeżywalność komórek.
3. Umieść probówkę (probówki) mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO₂ na 30 minut do 1 godziny, aby umożliwić całkowite roztrawienie żelu matrycowego przez dispazę.
4. Osadzać organoidy przez odwirowywanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
5. Dodać buforowaną fosforanem sól fizjologiczną (PBS) do osadu organoidowego i ponownie zawiesić, delikatnie strzepując.
   UWAGA: Niewystarczające ponowne zawieszenie osadu organoidowego może spowodować zanieczyszczenie materiału organoidowego resztkową dypazą lub żelem matrycowym.
6. Osadzać organoidy przez wirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze RT i usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
7. Szybko zamroź granulki organoidów, umieszczając każdą probówkę w roztworze zawierającym suchy lód i metanol. Probówkę (probówki) należy przechowywać do przyszłego użycia w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, wyekstrahować lizat białkowy natychmiast po kroku 1.6.
8. Zawiesić osady organoidów w 100 μl buforu do lizy białek (Tabela 1) na 10 μl objętości upakowanych komórek. Przesuń, aby ponownie zawiesić.
   UWAGA: W przypadku wznawiania po szybkim zamrożeniu, przed usunięciem próbek z -80 °C należy upewnić się, że bufor do lizy białek został rozmrożony, ponieważ bufor do lizy należy natychmiast dodać do próbek, aby zapobiec aktywności fosfatazy i proteazy.
9. Inkubuj próbki w buforze do lizy białek na lodzie przez co najmniej 45 minut.
   UWAGA: Zaleca się sonikację przed inkubacją na lodzie w celu zwiększenia efektywności odzyskiwania białek jądrowych; Sonikacja nie jest jednak wymagana. Jeśli sonikacja nie jest wykonywana, przejdź do kroku 1.10.
   1. Aby wykonać sonikat, zanurz probówki w mokrym lodzie i delikatnie przyłóż końcówkę dysmembratora sonicznego do probówki mikrowirówkowej. Sonikować przez 40 s przy 20 kHz.
10. Przejdź do Western blot zgodnie z ustalonymi protokołami.

Tabela 1: Instrukcje dotyczące przygotowania kluczowych rozwiązań

Przepisy
Pożywki zawierające prozazę	1 mg/ml dypazy + 10 μM inhibitor ROCK w zaawansowanym DMEM F12. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
Media dysocjacyjne	10% FBS + 1x penicylina-streptomycyna w RPMI 1640. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
Bufor do lizy białek	Bufor RIPA + inhibitory fosfatazy + inhibitory proteazy
Rozwiązanie blokujące	10% FBS w PBS z 0,2% Triton X-100

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A83-01	Tocris powiedział:	Numer katalogowy: 2939
Zaawansowany DMEM/F-12	Thermo Fisher Naukowy	12634010
Suplement B-27 (50x), bez surowicy	Thermo Fisher Naukowy	17504044
Dyspaza II, proszek	Thermo Fisher Naukowy	17-105-041
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma	F8667
GlutaMAX Thermo	Fisher Naukowy	35050061
Inhibitor fosfatazy halt	Thermo Fisher Naukowy	Numer telefonu 78428
Matrigel GFR Matryca membranowa	Corning CB-	40230C
N-acetylo-L-cysteina	Sigma	A9165
Normocin (Normocyna)	Thermo Fisher Naukowy	ANT-NR-1
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ ml)	Thermo Fisher Naukowy	15-140-122
Poli(2-hydroksyetylometakrylan) (Poli-HEMA)	Sigma	Zobacz materiał P3932-25G
Test radioimmunoprecypitacyjny (RIPA)	Thermo Fisher Naukowy	PI89901
Rekombinowany ludzki EGF, bez zwierząt	PeproTech	AF-100-15
Rekombinowany ludzki Noggin	PeproTech	120-10C
RPMI 1640 Średni, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Naukowy	22400105
Dysmubrator dźwiękowy	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał FB120
Tryton X-100	Sigma	X100-5ML
Dichlorowodorek Y-27632 (inhibitor ROCK)	Selleck Chemiczny	S1049-50MG

powiedział: (wersja angielska)