Obrazowanie immunofluorescencyjne w całości: technika utrwalania i barwienia do oceny nienaruszonych organoidów

Streszczenie

Źródło: Crowell, P. D. et al. Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film opisuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego nienaruszonych organoidów raka prostaty i ich obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej z pełnym wierzchołkiem. Technika ta ma na celu ocenę zdolności różnicowania ex vivo podstawnych i świetlnych komórek nabłonka prostaty.

Protokół

1. Utrwalanie i barwienie organoidów prostaty do analizy immunohistochemicznej za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Pobieranie organoidów prostaty z płytek 24-dołkowych — CZAS: 45-60 min
   UWAGA: Podczas pobierania organoidów prostaty do przetworzenia pod mikroskopią konfokalną bardzo ważne jest, aby obchodzić się z nimi ostrożnie, aby zachować ich strukturę. Poniższy protokół pobierania ma na celu zmniejszenie zakłóceń struktury organoidów podczas izolacji.
   1. Usunąć pożywkę z każdej studzienki płytki zawierającej organoidy, przechylając płytkę pod kątem 45°.
   2. Roztrawić żel matrycowy przez inkubację z....

Wyniki

Rycina 1: Analiza ekspresji markerów rodowych w organoidach prostaty za pomocą Western blot i mikroskopii konfokalnej z pełnym wierzchotem.(A) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego organoidów pochodzenia podstawnego (na górze) i luminalnego (na dole) po 7 dniach hodowli. Pasek skali = 100 μm. (B) Analiza Western blot organoidów pochodzenia podstawowego (Bas) i l.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16% paraformaldehyd	Thermo Fisher Naukowy	50-980-487
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał D1306
Zaawansowany DMEM/F-12	Thermo Fisher Naukowy	12634010
Dyspaza II, proszek	Thermo Fisher Naukowy	17-105-041
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma	F8667
Kozia anty-mysia IgG-Alexa Fluor 488	Invitrogen	Nr kat. A28175
Kozia anty-królik IgG-Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012
Mysia antycytokeratyna 8	Legenda biologiczna	904804
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher Naukowy	15-140-122
Królik anty-p63	Legenda biologiczna	619002
RPMI 1640 Średni, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Naukowy	22400105
sacharoza	Sigma	S0389-500G
Tryton X-100	Sigma	X100-5ML

powiedział: