$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Utrwalanie i barwienie organoidów prostaty do analizy immunohistochemicznej za pomocą mikroskopii konfokalnej
- Pobieranie organoidów prostaty z płytek 24-dołkowych — CZAS: 45-60 min
UWAGA: Podczas pobierania organoidów prostaty do przetworzenia pod mikroskopią konfokalną bardzo ważne jest, aby obchodzić się z nimi ostrożnie, aby zachować ich strukturę. Poniższy protokół pobierania ma na celu zmniejszenie zakłóceń struktury organoidów podczas izolacji.
- Usunąć pożywkę z każdej studzienki płytki zawierającej organoidy, przechylając płytkę pod kątem 45°.
- Roztrawić żel matrycowy przez inkubację z 500 μl pożywki zawierającej dypazę (tabela 1) przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 .
- Zebrać strawioną zawiesinę organoidów do probówki do mikrowirówki i zagnieździć organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
- Barwienie immunofluorescencyjne organoidów prostaty metodą całego mocowania — CZAS: 3-4 dni (1-5 h/dzień)
- Dodać 500 μl 4% paraformaldehydu do PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
- Umyj granulkę jak w kroku 1.2.2 dodatkowo dwa razy.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać 1 μg/ml DAPI do roztworu blokującego (Tabela 1). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub alternatywnie przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (królicze przeciwciało anty-p63, mysia anty-cytokeratyna 8) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Umyj granulkę 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
- Umyj granulkę jak w kroku 1.2.6 dodatkowo dwa razy.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze IgG-Alexa Fluor 594, kozie przeciwciało anty-mysie IgG-Alexa Fluor 488) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
- Umyć osad jak w kroku 1.2.9 dodatkowo dwa razy.
2. Oczyszczanie tkanek i montaż barwionych organoidów prostaty do pełnej mikroskopii konfokalnej — CZAS: 7 godzin
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
- Dodać 1 ml 30% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
- Dodać 1 ml 45% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
- Dodać 1 ml 60% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
- Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć 95% supernatantu.
UWAGA: Osad staje się luźniejszy wraz ze wzrostem stężenia sacharozy. Zaleca się obserwację organoidów wybarwionych DAPI w świetle UV w celu potwierdzenia, że nie zostały one utracone podczas usuwania supernatantu.
- Przenieść 10-20 μl kropli pozostałej zawiesiny do komorowego szkiełka nakrywkowego i przystąpić do mikroskopii konfokalnej.
UWAGA: Fragmenty szkiełka nakrywkowego można umieścić po obu stronach kropli, aby wykorzystać je jako przekładki (Rysunek 1C). Zapobiegają one zapadaniu się organoidów po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na kropli.
Tabela 1: Instrukcje dotyczące przygotowania kluczowych rozwiązań
| składnik | koncentracja |
| B-27 | 1x (rozcieńczyć od 50x koncentratu) |
| GlutaMAX | 1x (rozcieńczyć od 100x koncentratu) |
| N-acetylo-L-cysteina | 1,25 mM |
| Normocin (Normocyna) | 50 μg/ml |
| Rekombinowany ludzki EGF, wolny od zwierząt | 50 ng/ml |
| Rekombinowany ludzki Noggin | 100 ng/ml |
| Pożywki kondycjonowane R-spondyną 1 | 10% kondycjonowane media |
| A83-01 | 200 nM |
| Protokół DHT | 1 nM |
| Dichlorowodorek Y-27632 (inhibitor ROCK) | 10 μM |
| Zaawansowany DMEM/F-12 | Nośnik bazowy |
| Pożywka kondycjonowana R-spondyną 1 jest generowana zgodnie z opisem w Drost, et al. Po dodaniu wszystkich składników przefiltruj sterylizację mysich pożywek organoidowych za pomocą filtra 0,22 μm. Inhibitor ROCK dodaje się tylko podczas tworzenia hodowli i pasażowania organoidów. |
