Obrazowanie immunofluorescencyjne w całości: technika utrwalania i barwienia do oceny nienaruszonych organoidów

1. Utrwalanie i barwienie organoidów prostaty do analizy immunohistochemicznej za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Pobieranie organoidów prostaty z płytek 24-dołkowych — CZAS: 45-60 min
   UWAGA: Podczas pobierania organoidów prostaty do przetworzenia pod mikroskopią konfokalną bardzo ważne jest, aby obchodzić się z nimi ostrożnie, aby zachować ich strukturę. Poniższy protokół pobierania ma na celu zmniejszenie zakłóceń struktury organoidów podczas izolacji.
   1. Usunąć pożywkę z każdej studzienki płytki zawierającej organoidy, przechylając płytkę pod kątem 45°.
   2. Roztrawić żel matrycowy przez inkubację z 500 μl pożywki zawierającej dypazę (tabela 1) przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO₂ .
   3. Zebrać strawioną zawiesinę organoidów do probówki do mikrowirówki i zagnieździć organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
2. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów prostaty metodą całego mocowania — CZAS: 3-4 dni (1-5 h/dzień)
   1. Dodać 500 μl 4% paraformaldehydu do PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
   2. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
   3. Umyj granulkę jak w kroku 1.2.2 dodatkowo dwa razy.
   4. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać 1 μg/ml DAPI do roztworu blokującego (Tabela 1). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub alternatywnie przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
   5. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (królicze przeciwciało anty-p63, mysia anty-cytokeratyna 8) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
   6. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Umyj granulkę 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
   7. Umyj granulkę jak w kroku 1.2.6 dodatkowo dwa razy.
   8. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze IgG-Alexa Fluor 594, kozie przeciwciało anty-mysie IgG-Alexa Fluor 488) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
   9. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając.
   10. Umyć osad jak w kroku 1.2.9 dodatkowo dwa razy.

2. Oczyszczanie tkanek i montaż barwionych organoidów prostaty do pełnej mikroskopii konfokalnej — CZAS: 7 godzin

1. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
2. Dodać 1 ml 30% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
3. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
4. Dodać 1 ml 45% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
5. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
6. Dodać 1 ml 60% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
7. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć 95% supernatantu.
   UWAGA: Osad staje się luźniejszy wraz ze wzrostem stężenia sacharozy. Zaleca się obserwację organoidów wybarwionych DAPI w świetle UV w celu potwierdzenia, że nie zostały one utracone podczas usuwania supernatantu.
8. Przenieść 10-20 μl kropli pozostałej zawiesiny do komorowego szkiełka nakrywkowego i przystąpić do mikroskopii konfokalnej.
   UWAGA: Fragmenty szkiełka nakrywkowego można umieścić po obu stronach kropli, aby wykorzystać je jako przekładki (Rysunek 1C). Zapobiegają one zapadaniu się organoidów po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na kropli.

Tabela 1: Instrukcje dotyczące przygotowania kluczowych rozwiązań

Rycina 1: Analiza ekspresji markerów rodowych w organoidach prostaty za pomocą Western blot i mikroskopii konfokalnej z pełnym wierzchotem.(A) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego organoidów pochodzenia podstawnego (na górze) i luminalnego (na dole) po 7 dniach hodowli. Pasek skali = 100 μm. (B) Analiza Western blot organoidów pochodzenia podstawowego (Bas) i luminalnego (Lum) po 5 dniach hodowli. Barwienie markera podstawowego, cytokeratyny 5 (K5) i markera światła, cytokeratyny 8 (K8) i kontroli obciążenia, histonu H3 (HH3). (C) Schemat ilustrujący komorowe szkiełko nakrywkowe z przekładkami. (D) Reprezentatywne obrazy różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i immunofluorescencji organoidów pochodzących z bazy (na górze) i w świetle (na dole) po 7 dniach hodowli. Barwienie dla p63 (czerwony), K8 (zielony) i DAPI (niebieski) pojedynczo i połączone. Podziałka = 100 μm.