Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
2.8K wyświetleń
⸱
30 kwietnia 2023
Źródło: Chen S. et al. Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu dla charakterystyki pojedynczej komórki. J. Vis. Exp. (2018)
W tym filmie pokazujemy izolację komórek raka nabłonka wykazującego ekspresję EpCAM z próbek krwi obwodowej. Technika ta polega na użyciu drutu klasy medycznej funkcjonalizowanego przeciwciałami EpCAM w celu wychwycenia komórek docelowych. Schwytane komórki są następnie ekstrahowane do roztworu buforowego.
UWAGA: Ten protokół opisuje izolację komórek HT-29 (linia komórkowa ludzkiego raka jelita grubego) z PBS lub ze sztucznych mieszanek komórek HT-29 i krwi obwodowej. Ten sam eksperyment został przeprowadzony z dwiema dodatkowymi liniami komórkowymi (LNCaP i VCaP) i teoretycznie można go przeprowadzić ze wszystkimi komórkami wykazującymi ekspresję EpCAM.
1. Przygotowanie komórek docelowych
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Rysunek 1: Wizualizacja oznaczonych komórek.(A,E) Komórki przed naładowaniem: Komórki są znakowane CFSE i barwione barwnikiem interkalacyjnym DNA wykazującym zakres intensywności sygnału CFSE (zielony). (B,F) Oznaczone komórki uchwycone na przewodzie. (C,G) Drut po procedurze odłączania komórek. (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bufor zwalniający Gilupi | Gilupi powiedział: | GIL083 | Służy do odłączania ogniw od przewodu |
| McCoy's 5A Medium (1x) suplement z L-Glutaminą | Thermo Fisher Naukowy | 16600-082 | Pożywka hodowlana stosowana do komórek HT-29, dostosować pożywkę hodowlaną do linii komórkowej używanej do eksperymentów |
| Roztwór buforowy HEPES (1 m) | PAA (Agencja Ochrony | S11-001 | Suplement do pożywki McCoy's 5A |
| Złota surowica bydlęca dla płodu | PAA (Agencja Ochrony | A15-151 | Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a |
| Penicylina-Streptomycyna (100x) | Biowest (Zachód Biologi | L0018-100 | Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS) | Thermo Fisher Naukowy | Numer katalogowy 10010-015 | |
| Dokładności | Biowest (Zachód Biologi | L0950-100 | Roztwór do odrywania komórek (hodowla komórkowa) |
| Kąpiel wodna | Język niemiecki | Typ 1003 | Służy do roztworów do wstępnego podgrzewania |
| inkubator | Thermo Fisher Naukowy | Służy do inkubacji komórek (hodowla komórkowa) | |
| 50 ml probówek reakcyjnych | Firma VWR | 525-0403 | |
| Mieszalnik rolkowy | Stuart Naukowy | Zobacz materiał SRT6D | Służy do mocowania komórek do drutu, jednocześnie zapobiegając osadzaniu się komórek |
| Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE | Thermo Fisher Naukowy | Zobacz materiał C34554 | Służy do oznaczania żywych komórek (znacznik cytoplazmatyczny) |
| Hoechst 33342 | Zobacz materiał H3570 | Thermo Fisher Naukowy | Służy do barwienia DNA (przeciwbarwienie nukleinowe) |
| Wirówka (wyposażona w 15 ml i 50 ml probówek reakcyjnych) | Thermo Fisher Naukowy | Heraeus Megafuge 40R | Służy do komór do peletowania |
| Obserwator Z1 (Mikroskop fluorescencyjny/mikrodyparacyjny laserowy) | Mikroobrazowanie Carla Zeissa | Mikroskop odwrócony (immunofluorescencyjny) zdolny do mikrodysekcji laserowej; Mikroskopy fluorescencyjne muszą być w stanie wykryć Hoechst 33342 (filtr DAPI) i CFSE (filtr FITC) | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Służy do powlekania powierzchni szklanych/plastikowych |
| Minishaker MS1 | Sigma-Aldrich | Z404039 | Służy do wirowania |
| Probówki próżniowe EDTA (lub Na-heparyna) | Bd | 366450 (lub 366480) | Używany jako probówka reakcyjna do wychwytywania komórek docelowych ex vivo |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi powiedział: | GIL003 | Funkcjonalizowany drut zdolny do izolowania i odłączania komórek EpCAM-dodatnich (określanych również jako catch&release, C&R) |
| Igły strzykawkowe (G20) | Firma VWR | 613-0554 | Służy do nakłuwania gumowych zaślepek w celu umożliwienia przeprowadzenia przez nie niefunkcjonalnej części C&R |
| Komora Neubauera | Roth | T729.1 | Służy do liczenia komórek |
| Pipety Pasteura 150 mm | Wolak | Zobacz materiał D810 | Służy do nakładania ogniw na małą objętość do C&R |
| Smarowidło | Dako Dako | S2002 | Stosowany na szkiełkach do utrzymywania zawiesiny komórek na miejscu |
| Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μm) | Corning | 431219 | Do filtrowania świeżo przygotowanego bufora Gilupi Release Buffer |
| Wytrząsarka do płyt Delfia | Perkin Elmer | Numer katalogowy: 1296-003 | Służy do mieszania podczas odłączania komórek |
| Probówki 1,5 ml | Eppendorf | 30 125 150 | |
| Zestaw Ampli1 WGA | Biosystemy krzemowe | Do zamówienia za pośrednictwem Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 wyposażony w Mikromanipulator MMJ i CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Korzystaj z mikromanipulacji pod ręką | |
| Mikrokapilary (średnica 25 μm), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Służy do mikromanipulacji komórkami |
| 0,2 ml probówek do PCR | Biozym | Numer katalogowy: 710920 | |
| Cytowirówka i sprzęt | Hettich powiedział: | Uniwersalny 32 | Używaj cytowirówki pod ręką |
| Termocykler | Bio-Rad | Diada silnika DNA | Można używać każdego termocyklera z podgrzewaną pokrywą |
| Mikrowirówka | Roth | CX73.1 | Używaj wirówki biurkowej pod ręką |
| Membrana SlideSlide 1.0 PET | Zeiss | Numer telefonu 415101-4401-050 | Szkiełka szklane powlekane membraną do mikrodysekcji laserowej |
