Funkcjonalizowana izolacja komórek docelowych na bazie drutów: technika ex vivo izolowania komórek rakowych z wzbogaconej krwi obwodowej

Streszczenie

Źródło: Chen S. et al. Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu dla charakterystyki pojedynczej komórki. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie pokazujemy izolację komórek raka nabłonka wykazującego ekspresję EpCAM z próbek krwi obwodowej. Technika ta polega na użyciu drutu klasy medycznej funkcjonalizowanego przeciwciałami EpCAM w celu wychwycenia komórek docelowych. Schwytane komórki są następnie ekstrahowane do roztworu buforowego.

Protokół

UWAGA: Ten protokół opisuje izolację komórek HT-29 (linia komórkowa ludzkiego raka jelita grubego) z PBS lub ze sztucznych mieszanek komórek HT-29 i krwi obwodowej. Ten sam eksperyment został przeprowadzony z dwiema dodatkowymi liniami komórkowymi (LNCaP i VCaP) i teoretycznie można go przeprowadzić ze wszystkimi komórkami wykazującymi ekspresję EpCAM.

1. Przygotowanie komórek docelowych

1. Hodowla komórkowa i znakowanie komórek
   nuta: W tym protokole komórki są hodowane w kolbach hodowlanych o powierzchni 75 cm². Jeśli używane są inne urządzenia do hodowli komórkowych, należy odpowiednio dostosować ilości odczynników (np. szalki hodowlane o powierzchni 25 cm², płytki 6-dołkowe itp.). Wszystkie używane płyny są wstępnie podgrzewane do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie kroki protokołu są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT).
   1. Hodowla komórek HT-29 w zmodyfikowanej pożywce McCoy's 5a uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 20 mM Hepes, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ .
   2. Gdy komórki są w 90% zlewne, usuń pożywkę i przepłucz komórki 10 ml 1x PBS.
   3. W celu pobrania komórek należy dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek (tabela materiałów i odczynników) do komórek i inkubować komórki przez około 5 minut w temperaturze 37 °C.
      nuta: Roztwór oddzielający zawiera enzymy proteolityczne i kolagenolityczne w 1x PBS, 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 3 mg/L czerwieni fenolowej. Skrócić czas wstępnego podgrzewania roztworu do oddzielania komórek do minimum, ponieważ stanie się on nieaktywny po 1 godzinie w temperaturze 37 °C. Przykryj całą warstwę komórek, aby uzyskać optymalne oddzielenie komórek.
   4. Sprawdź oderwanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu.
   5. Przenieść wszystkie oderwane komórki do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych (takiej samej, jak użytej w kroku 1.1.1) i ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie.
   6. Umieść pozostałą zawiesinę komórek na poziomym mieszadle rolkowym w punkcie RT i przejdź do etapu etykietowania.
2. Oznaczanie żywych komórek docelowych
   1. Rozcieńczyć 1 μL 5 mM CFSE (dostarczanego w dimetylosulfotlenku, DMSO) w 1 ml 1x PBS wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C, aby otrzymać 5 μM gotowy do użycia roztwór do etykietowania CFSE.
      nuta: Aby uzyskać optymalne wyniki barwienia, używaj świeżo przygotowanych roztworów.
   2. Przygotować gotowy do użycia roztwór do barwienia DNA (Tabela materiałów i odczynników) w 1x PBS i przechowywać w temperaturze 2-6 °C, chronić przed światłem.
      nuta: Aby uzyskać optymalne wyniki barwienia, używaj świeżo przygotowanych roztworów.
   3. Pobrać komórki z poziomego mieszalnika walcowego (krok 1.1.6.) i granulować komórki w temperaturze 300 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml 1x PBS.
   4. Ponownie przepłucz komórki 1x PBS i ponownie zawieś osad komórek w 500 μl gotowym do użycia roztworze do etykietowania CFSE.
   5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 15 minut i zbierać komórki po odwirowaniu w temperaturze 300 x g przez 3 minuty.
   6. Zawiesić znakowane komórki w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom na regenerację w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   7. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić granulki komórek w 1 ml gotowego do użycia roztworu do barwienia DNA w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
   8. Osadzać komórki, usuwać supernatant i ponownie zawieś komórki w 4 ml 1x PBS. Ocenić gęstość komórek za pomocą hemocytometru i sprawdzić znakowanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (ryc. 1A i 1E).
   9. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić osad komórkowy zgodnie z gęstością komórek potrzebną do odpowiedniego doświadczenia, jak podano w następnej sekcji, i umieścić na lodzie.

2. Ładowanie przewodu

UWAGA: Komórki mogą być izolowane z komórek docelowych/obwodowych w skali mililitrowej lub poprzez dostarczenie małej liczby komórek w skali mikrolitrowej. Podczas gdy pierwsze podejście pozwala na naśladowanie rzadkich komórek we krwi obwodowej, drugie może być preferowanym sposobem przyłączenia kilku komórek w celu optymalizacji/testowania protokołu.

1. Ładowanie drutu za pomocą dużej objętości zawiesin ogniw
   1. Przygotować 2% roztwór blokujący BSA, rozpuszczając 0,8 g BSA w 40 ml 1x PBS (zastosowanie w hodowli komórkowej). Rozpuścić BSA poprzez wstępne wirowanie, a następnie inkubację w temperaturze pokojowej na poziomym mieszalniku rolkowym przez 10-20 minut.
   2. Przepłukać puste probówki EDTA/heparyny sodowej 2 ml 2% BSA w celu usunięcia pozostałości antykoagulantu i wyrzucić roztwór. Zablokować powierzchnię probówki przez inkubację w temperaturze pokojowej z 5 ml 2% BSA na poziomym mieszadle rolkowym z prędkością 15 obr./min przez 30 minut i wyrzucić roztwór.
   3. Rozcieńczyć znakowane ogniwa (sekcja 1.2.) do gęstości 100 000 komórek/ml i użyć 5 ml do naładowania drutu.
   4. Dodaj 5 ml oznakowanej zawiesiny komórek (w sumie 500 000 komórek) do probówki. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas dodawania zawiesiny komórkowej.
   5. Wyjmij przewód ze schowka oraz gumową nasadkę przytrzymującą przewód i wypłucz go w 1x PBS (Rysunek 2).
   6. Przebić gumową nasadkę rurki EDTA (krok 2.1.4.) za pomocą igły strzykawkowej (20 G) i wprowadzić drut w taki sposób, aby część funkcjonalna była całkowicie zanurzona w zawiesinie komórki, gdy nasadka znajduje się z powrotem na probówce, a rurka jest umieszczona na przechylonym mieszadle rolkowym.
      nuta: Potrójnie spiralna część funkcjonalna przewodu powinna być pokryta zawieszeniem ogniwa przez cały czas ładowania.
   7. Obracaj rurki na przechylonym mieszadle rolkowym z prędkością 5 obr./min przez 30 minut, aby umożliwić ogniwom przymocowanie się do drutu.
   8. Przepłukać drut 5 ml 1x PBS i przechowywać go w ciemności w temperaturze 2-6 °C w probówce 15 ml zawierającej 1x PBS do czasu oględzin.
      nuta: Funkcjonalna część drutu musi być zawsze zanurzona w PBS, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
2. Izolowanie komórek docelowych ze sztucznych mieszanin z krwią obwodową (alternatywna metoda ładowania dla: 2.1. Ładowanie przewodu za pomocą dużej objętości zawiesin ogniw)
   1. Rozcieńczyć znakowane komórki (sekcja 1.2.) w celu uzyskania zawiesin komórkowych o dużej gęstości komórek (> 1 000 000 komórek/ml), utrzymując w ten sposób objętość zawiesiny komórkowej dodawanej do krwi obwodowej na niskim poziomie.
   2. Dodaj od 500 do 500 000 komórek do 5 ml krwi obwodowej i wymieszaj je, odwracając probówkę.
   3. Wyjmij drut ze schowka, zdejmij gumową nasadkę przytrzymującą drut i opłucz go w 1x PBS.
   4. Przebić nową nasadkę probówki niedziałającą częścią urządzenia za pomocą igły strzykawkowej (20 G) w taki sposób, aby część funkcjonalna była całkowicie zanurzona w wzbogaconej krwi, gdy nasadka znajduje się z powrotem na probówce, a rurka jest umieszczana na przechylonym mieszadle rolkowym.
      nuta: Potrójnie spiralna część funkcjonalna przewodu powinna być pokryta zawieszeniem ogniwa przez cały czas ładowania.
   5. Inkubować probówkę na przechylonym mieszadle rolkowym z prędkością 5 obr./min przez 30 min w temperaturze suchej.
   6. Przepłucz drut trzy razy w 1x PBS i przechowuj go w ciemności w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1x PBS do czasu oględzin.
      nuta: Funkcjonalna część drutu musi być zawsze zanurzona, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
3. Ładowanie przewodu z zawieszeń ogniw o małej objętości (alternatywna metoda ładowania do: 2.1. Ładowanie przewodu za pomocą dużej objętości zawiesin ogniw)
   1. Ponownie zawiesić znakowane komórki na poziomie 1 000 000 komórek/ml w 1x PBS.
   2. Zamocuj jednorazową szklaną pipetę Pasteura o średnicy 150 mm poziomo na stojaku.
   3. Wyjmij przewód ze schowka, ale zachowaj żółtą gumową nasadkę przytrzymującą przewód.
   4. Umieść drut w pipecie w taki sposób, aby funkcjonalizowana część znajdowała się na końcówce pipety Pasteura i nie dotykała szkła.
      nuta: Końcówka drutu nie powinna wystawać z końcówki pipety Pasteura. Unikaj zatykania tylnego końca końcówki pipety Pasteura gumową nasadką przytrzymującą przewód. Jeśli są mocno zamocowane, zawiesiny komórek nie mogą być ładowane z drugiej strony do końcówki pipety.
   5. Załadować 15 μl zawiesiny komórek do końcówki pipety Pasteura zakrywającej funkcjonalizowaną część drutu.
   6. Inkubuj drut przez 10 minut. Ręcznie obracaj zmontowany drut/końcówkę pipety Pasteura o ćwierć sekundy co minutę.
   7. Usunąć drut z końcówki pipety Pasteura, wypłukać go w 5 ml 1x PBS i przechowywać w ciemności w temperaturze 2-6 °C w probówce 15 ml zawierającej 1x PBS do czasu oględzin.
      nuta: Część funkcjonalna musi być zawsze zanurzona w 1x PBS, aby uniknąć uszkodzenia komórek.

3. Liczenie komórek na przewodzie

UWAGA: Zawsze utrzymuj funkcjonalną część przewodu zanurzoną w 1x PBS, aby uniknąć uszkodzenia komórek.

1. Za pomocą pisaka do smaru narysuj prostokątny obszar na szklanym szkiełku podstawowym i dodaj 500 μl 1x PBS.
2. Zegnij niefunkcjonalną część drutu i umieść ją na szklanym szkiełku tak, aby część funkcjonalna była zanurzona w 1x PBS.
   nuta: Dopasuj obszar prostokąta i objętość 1x PBS, aby całkowicie zakryć funkcjonalną część drutu. Użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby zamontować niefunkcjonalną część drutu na prowadnicy.
3. Sprawdź wzrokowo obie strony przewodu, aby wyliczyć przechwycone komórki (Rysunek 1B i 1F).
   nuta: Obecność komórek określa się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry do DAPI i FITC. Obie strony przewodu mogą być sprawdzane, a liczba ogniw może być oceniana (w przypadku dużej liczby ogniw) lub liczona (możliwe tylko wtedy, gdy do drutu podłączona jest mała liczba ogniw). Ten krok można pominąć, jeśli wyliczanie komórek nie jest konieczne.
4. Po zeskanowaniu umieść drut z powrotem w probówce 15 ml zawierającej 1x PBS, przechowuj drut w ciemności.
   nuta: Większość niefunkcjonalnej części drutu można przeciąć (w tym zagięcie) i usunąć, co ułatwia przechowywanie.

4. Odłączanie i odzyskiwanie komórek docelowych

UWAGA: Odłączenie komórek powinno nastąpić w ciągu 4 godzin po izolacji.

1. Rozpuścić 4 mg składnika buforowego o uwalnianiu (tabela materiałów i odczynników) na ml 1x PBS i przefiltrować roztwór przez sterylny filtr 0,2 μm w celu uzyskania gotowego do użycia buforu.
   nuta: Polimer drutu składa się z hydrożelu, który jest funkcjonalizowany przeciwciałami anty-EpCAM, umożliwiającymi wiązanie się z komórkami docelowymi prezentującymi EpCAM. Bufor uwalniający zawiera enzym proteolityczny węglowo-tlenowy zdolny do rozszczepienia hydrożelu. Rozszczepienie proteolityczne powoduje degradację polimeru, a tym samym oderwanie się wychwyconych komórek.
2. Podgrzewać bufor uwalniający w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
3. Dodać 1,6 ml buforu do uwalniania, aby napełnić probówkę reakcyjną o pojemności 1,5 ml.
   nuta: Probówki przeznaczone do objętości reakcyjnych 1,5 ml pozwalają na aplikację 1,6 ml, która jest niezbędna do zanurzenia funkcjonalnej części drutu.
4. Inkubować funkcjonalną część drutu w buforze uwalniającym w temperaturze 37 °C (łaźnia wodna) przez 20 minut. Użyj gumowej nasadki dostarczonej z drutem zamiast nasadki probówki, aby zamocować drut w probówce o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas inkubacji w łaźni wodnej.
5. Przenieś zespół drutu/rurki do wytrząsarki z prędkością 500 obr./min przez 15 min.
   nuta: Wytrząsarka ma orbitę 1,5 mm.
6. Umieść zespół drutu/rurki w wirówce i wiruj go z prędkością 300 x g przez 10 minut.
7. Wyjmij drut z probówki, zamknij nakrętkę i ponownie odwiruj probówkę przy 300 x g przez 10 min.
   nuta: Drut może być przechowywany w 1x PBS w temperaturze 2-6 °C w ciemności w celu zliczania komórek w celu oceny wydajności odłączania/sprawdzenia, czy ogniwa pozostały na przewodzie.
8. Aby zmniejszyć objętość zawiesiny komórek, należy usunąć wszystkie z wyjątkiem 100 μl (mikromanipulacja) lub alternatywnie 300 μl (cytowirowanie i późniejsza mikrodysekcja laserowa) supernatantu i natychmiast przystąpić do pobierania próbek z pojedynczych komórek.

Wyniki

Rysunek 1: Wizualizacja oznaczonych komórek.(A,E) Komórki przed naładowaniem: Komórki są znakowane CFSE i barwione barwnikiem interkalacyjnym DNA wykazującym zakres intensywności sygnału CFSE (zielony). (B,F) Oznaczone komórki uchwycone na przewodzie. (C,G) Drut po procedurze odłączania komórek. (

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor zwalniający Gilupi	Gilupi powiedział:	GIL083	Służy do odłączania ogniw od przewodu
McCoy's 5A Medium (1x) suplement z L-Glutaminą	Thermo Fisher Naukowy	16600-082	Pożywka hodowlana stosowana do komórek HT-29, dostosować pożywkę hodowlaną do linii komórkowej używanej do eksperymentów
Roztwór buforowy HEPES (1 m)	PAA (Agencja Ochrony	S11-001	Suplement do pożywki McCoy's 5A
Złota surowica bydlęca dla płodu	PAA (Agencja Ochrony	A15-151	Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a
Penicylina-Streptomycyna (100x)	Biowest (Zachód Biologi	L0018-100	Suplement do pożywki modyfikowanej McCoy's 5a
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 10010-015
Dokładności	Biowest (Zachód Biologi	L0950-100	Roztwór do odrywania komórek (hodowla komórkowa)
Kąpiel wodna	Język niemiecki	Typ 1003	Służy do roztworów do wstępnego podgrzewania
inkubator	Thermo Fisher Naukowy		Służy do inkubacji komórek (hodowla komórkowa)
50 ml probówek reakcyjnych	Firma VWR	525-0403
Mieszalnik rolkowy	Stuart Naukowy	Zobacz materiał SRT6D	Służy do mocowania komórek do drutu, jednocześnie zapobiegając osadzaniu się komórek
Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał C34554	Służy do oznaczania żywych komórek (znacznik cytoplazmatyczny)
Hoechst 33342	Zobacz materiał H3570	Thermo Fisher Naukowy	Służy do barwienia DNA (przeciwbarwienie nukleinowe)
Wirówka (wyposażona w 15 ml i 50 ml probówek reakcyjnych)	Thermo Fisher Naukowy	Heraeus Megafuge 40R	Służy do komór do peletowania
Obserwator Z1 (Mikroskop fluorescencyjny/mikrodyparacyjny laserowy)	Mikroobrazowanie Carla Zeissa		Mikroskop odwrócony (immunofluorescencyjny) zdolny do mikrodysekcji laserowej; Mikroskopy fluorescencyjne muszą być w stanie wykryć Hoechst 33342 (filtr DAPI) i CFSE (filtr FITC)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Służy do powlekania powierzchni szklanych/plastikowych
Minishaker MS1	Sigma-Aldrich	Z404039	Służy do wirowania
Probówki próżniowe EDTA (lub Na-heparyna)	Bd	366450 (lub 366480)	Używany jako probówka reakcyjna do wychwytywania komórek docelowych ex vivo
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi powiedział:	GIL003	Funkcjonalizowany drut zdolny do izolowania i odłączania komórek EpCAM-dodatnich (określanych również jako catch&release, C&R)
Igły strzykawkowe (G20)	Firma VWR	613-0554	Służy do nakłuwania gumowych zaślepek w celu umożliwienia przeprowadzenia przez nie niefunkcjonalnej części C&R
Komora Neubauera	Roth	T729.1	Służy do liczenia komórek
Pipety Pasteura 150 mm	Wolak	Zobacz materiał D810	Służy do nakładania ogniw na małą objętość do C&R
Smarowidło	Dako Dako	S2002	Stosowany na szkiełkach do utrzymywania zawiesiny komórek na miejscu
Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μm)	Corning	431219	Do filtrowania świeżo przygotowanego bufora Gilupi Release Buffer
Wytrząsarka do płyt Delfia	Perkin Elmer	Numer katalogowy: 1296-003	Służy do mieszania podczas odłączania komórek
Probówki 1,5 ml	Eppendorf	30 125 150
Zestaw Ampli1 WGA	Biosystemy krzemowe		Do zamówienia za pośrednictwem Silicon Biosystems
Axiovert M200 wyposażony w Mikromanipulator MMJ i CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Korzystaj z mikromanipulacji pod ręką
Mikrokapilary (średnica 25 μm), CustomTip Type I	Eppendorf	930001201	Służy do mikromanipulacji komórkami
0,2 ml probówek do PCR	Biozym	Numer katalogowy: 710920
Cytowirówka i sprzęt	Hettich powiedział:	Uniwersalny 32	Używaj cytowirówki pod ręką
Termocykler	Bio-Rad	Diada silnika DNA	Można używać każdego termocyklera z podgrzewaną pokrywą
Mikrowirówka	Roth	CX73.1	Używaj wirówki biurkowej pod ręką
Membrana SlideSlide 1.0 PET	Zeiss	Numer telefonu 415101-4401-050	Szkiełka szklane powlekane membraną do mikrodysekcji laserowej