Pobieranie próbek z pojedynczych komórek za pomocą mikromanipulacji: technika izolowania pojedynczych komórek z zawiesiny komórek rakowych

Streszczenie

Źródło: Chen S. et al. Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu dla charakterystyki pojedynczej komórki. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę izolowania pojedynczych komórek z puli komórek docelowych w celu przeprowadzenia dalszej analizy. W tej metodzie mikromanipulator zamontowany w mikroskopie służy do bardzo precyzyjnej izolacji pojedynczej komórki docelowej.

Protokół

1. Próbkowanie pojedynczej komórki

1. Mikromanipulacja
   UWAGA: Aby umożliwić dalsze zastosowania, takie jak analiza całego genomu (WGA), izolowane pojedyncze komórki zostaną dodane do 2 μl głównej mieszanki do lizy komórek. Przygotuj mieszankę wzorcową w zależności od liczby komórek do przetworzenia. Obliczyć dodatkowe objętości do strat spowodowanych pipetowaniem i umieścić główną mieszankę do lizy komórek na lodzie.
   1. Przygotować główną mieszankę do lizy komórek (składniki zestawu WGA, tabela materiałów i odczynników). Krótko wymieszać 2,0 μl buforu reakcyjnego, 1,3 μl oktylofenoksypolietylenu (10% roztwór), 1,3 μl glikolu 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylopolietylenu (10% roztwór), 2,6 μl roztworu proteinazy K i 12,8 μl wody wolnej od RNazy/DNazy, aby otrzymać mieszankę wzorcową na 10 próbek (całkowita objętość 20 μl).
      nuta: Aby uzyskać więcej próbek, należy odpowiednio zwiększyć objętość.      
   2. Użyj pisaka do smaru, aby narysować obszar utrzymujący zawiesinę komórek na miejscu. Dostosuj obszar i objętość, jeśli gęstość komórek jest zbyt wysoka (tj. zaznacz większy obszar na szkiełku podstawowym, załaduj 1x PBS i podwielokrotność zawiesiny komórek).
   3. Odpipetować całą zawiesinę komórki docelowej na szkiełko podstawowe.
   4. Przenieś szklane szkiełko do mikroskopu wyposażonego w mikromanipulator. Pozwól komórkom osiąść przez 5 minut.
   5. Przygotować 0,2 ml probówki do PCR wypełnione 2,0 μl głównej mieszanki do lizy komórek (przygotowanej w kroku 1.1.1.) i przechowywać ją na lodzie.
   6. Zebrać pojedyncze komórki w 1 μL 1x PBS za pomocą mikromanipulatora i przenieść komórki do probówki zawierającej główną mieszankę do lizy komórek.
      nuta: W celu przeniesienia mikromanipulowanych komórek do buforu do lizy komórek, należy umieścić kapilarnę bezpośrednio w 2 μl roztworu do lizy i wyrzucać, aż będzie widać pęcherzyki.
   7. Krótko odwirować próbkę przy 2000 x g przez 3 sekundy za pomocą biurkowej mikrorurki, aby zebrać cały płyn na dnie probówki. Umieścić próbki na lodzie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 10010-015
Probówki próżniowe EDTA (lub Na-heparyna)	Bd	366450 (lub 366480)	Używany jako probówka reakcyjna do wychwytywania komórek docelowych ex vivo
Pipety Pasteura 150 mm	Wolak	Zobacz materiał D810	Służy do nakładania ogniw na małą objętość do C&R
Smarowidło	Dako Dako	S2002	Stosowany na szkiełkach do utrzymywania zawiesiny komórek na miejscu
Axiovert M200 wyposażony w Mikromanipulator MMJ i CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Korzystaj z mikromanipulacji pod ręką
Mikrokapilary (średnica 25 μm), CustomTip Type I	Eppendorf	930001201	Służy do mikromanipulacji komórkami
0,2 ml probówek do PCR	Biozym	Numer katalogowy: 710920

powiedział: