Generowanie chemoopornych komórek raka prostaty: procedura uzyskiwania lekoopornych komórek rakowych in vitro

Streszczenie

Źródło: Mohr, L. et al. Generacja modeli komórkowych raka prostaty oporności na środek antymitotyczny Docetaksel. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film opisuje protokół generowania odpornych na taksany modeli komórkowych raka prostaty. Modele te mogą pomóc w badaniu szlaków zaangażowanych w progresję oporności na docetaksel u pacjentów z rakiem prostaty.

Protokół

1. Generacja komórek raka prostaty opornych na docetaksel

UWAGA: Przeprowadź zabiegi komórkowe przy użyciu roztworu Docetakselu użytego do określenia stężenia leku IC50 (przygotuj wcześniej wystarczającą ilość zapasu do użytku eksperymentalnego). Komórki rodzicielskie powinny być hodowane równolegle w małej kolbie przez cały czas trwania procedury i poddawane działaniu nośnika (DMSO) w odpowiednich objętościach, naśladując ilości użyte w kolbach poddanych działaniu docetakselu.

1. Płytka: komórki DU145 lub 22Rv1 w 150 cm,² kolby zawierające 20 ml pożywki (3,5 x 10,⁶ komórek na kolbę dla DU145 i 6,5 x 10,⁶ komórek na kolbę dla 22Rv1). Zaleca się użycie od 10 do 20 kolb komórek, aby mieć wystarczającą liczbę komórek na końcu protokołu.
2. Po 24 godzinach, gdy komórki znajdują się w około 70-80% zbiegu (Figura 1B, przed Docetakselem), dodaj Docetaksel w stężeniu IC50 (5 nM dla komórek opisanych w tym protokole).
3. Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać świeżą, wolną od docetakselu pożywkę (ryc. 1B, 72 godziny po doscetakselu). Zmieniaj nośnik co 3-4 dni. W ciągu około 1-2 tygodni oporne klony pojawią się widoczne pod mikroskopem (Figura 1B, 7 i 14 dni po docetakselu).
4. Odessać pożywkę, ostrożnie przemyć komórki 15 ml PBS i inkubować z 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w celu oderwania komórek od powierzchni kolby.
5. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w kolbie, używając 8 ml świeżej pożywki. Pula komórek ze wszystkich kolb poddanych działaniu środka . Komórki osadu przez odwirowanie (300 x g, 3 min, RT).
6. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 20 ml świeżej pożywki i umieścić komórki w² kolbach o długości 150 cm (3,5 x 10⁶ komórek na kolbę dla DU145 i 6,5 x 10⁶ komórek na kolbę dla 22Rv1).
7. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną około 70-80% zbieżności, ponownie dodaj 5 nM Docetakselu (początkowe stężenie IC50).
8. Powtórz kroki od 1.3 do 1.6 w dniu 3.
9. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną około 70-80% konfluencji, potraktuj je 2X stężeniem docetakselu IC50 (10 nM dla komórek opisanych w tym protokole).
10. Powtórzyć kroki od 1.3 do 1.8, po zwiększeniu dawki stężenia docetakselu (25 nM, 50 nM, 100 nM i 250 nM), aby wytworzyć stabilną populację komórek rosnących w kolbach przy ostatnim najwyższym stężeniu. W przypadku wyższych stężeń protokół eskalacji dawki może być stosowany przez okres do 6 miesięcy, aż do osiągnięcia stężenia 1 000 nM (ryc. 2A).

Wyniki

Rycina 1: Generowanie systemów modelowych komórek raka prostaty opornych na docetaksel.(A) Schemat przedstawiający oznaczanie docetakselu IC50 w rodzicielskich liniach komórkowych raka gruczołu krokowego DU145 i 22Rv1 (krok 1 protokołu). Uwzględniono oczekiwany procent żywotności komórek i stężenia docetakselu wymagane do zwiększenia dawki. Uwzględniono reprezentatywne wykresy żywot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogniwa DU145	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-81
Ogniwa 22Rv1	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2505
Docetaksel	Selleck Chemikalia	Zobacz materiał S1148	w DMSO (10mM)
Kolba do hodowli tkankowych 150cm^{2}	sokół	355001
RPMI 1640 Średni	Gibco (firma Gibco)	11875093	Uzupełniony 10% FBS i 1% Penicylina/Streptomycyna
Fundacja B Surowica bydlęca płodu	Bliźnięta	900208
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Corning	21-040-CM
0,05% Trypsyna-EDTA	Gibco (firma Gibco)	25300-062
Penicylina-Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	15140122