1. Przygotowanie komórek do obrazowania na żywo
- Hoduj komórki CWR22Rv1 eksprymujące zielony fluorescencyjny łańcuch lekki sprzężony z białkiem 3 (LC3-GFP) w pożywkach hodowlanych RPMI zawierających 10% FBS i 1% antybiotyków na 35-milimetrowych szalkach hodowlanych ze szklanym dnem pokrytych poli-D-lizyną. Komórki powinny być posiane z wystarczającą gęstością, aby ułatwić szybką proliferację, ale nie na tyle, aby komórki były przerośnięte i zlepione do czasu obrazowania.
- Potraktuj wybrane próbki komórek ADI (0,3 μg/ml) w PBS.
- Około 1 godzinę przed obrazowaniem rozcieńczyć 1,5 μl LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) w 20 ml RPMI zawierającym 10% FBS i 1% antybiotyków. Roztwory zawierające dopuszczalne dzienne spożycie należy stosować do wybranych próbek. Podgrzej wszystkie podłoża do temperatury 37 °C przed dodaniem ich do naczynia hodowlanego.
- Inkubować komórki z RPMI zawierającym LysoTracker Red DND-99 przez 15-45 minut w temperaturze 37 °C.
- Na około 30 minut przed obrazowaniem włącz obudowę środowiskową WeatherStation i pozwól na wyrównanie do 37 °C i 5% CO2 (przy nawilżonym powietrzu).
- Umyj komórki PBS i zastąp pożywkę standardowym RPMI zawierającą tylko 10% FBS i 1% antybiotyków. Dodaj ADI do próbek zgodnie ze wskazaniami.
- Zamontuj 35-milimetrowe naczynia hodowlane ze szkłem nakrywkowym w niestandardowym adapterze (Applied Precision, Inc., WA) i umieść na stoliku mikroskopu. Użyj olejku immersyjnego (współczynnik załamania światła 1.520) na soczewce obiektywu 60X 1.42 NA i umieść zamontowaną miskę hodowlaną na scenie.
2. Mikroskopia z oświetleniem strukturalnym (OMX) o wysokiej rozdzielczości
UWAGA: Protokół w tej sekcji dotyczy korzystania z mikroskopu oświetlenia strukturalnego OMX (Applied Precision, WA).
- Włącz główne zasilanie i żądane lasery (410 nm, 488 nm i/lub 532 nm). Odczekaj 20 minut, aż lasery zostaną ustabilizowane termicznie.
- Dodaj olejek immersyjny (współczynnik załamania światła 1,516 dla próbek stałych przy RT) na soczewkę obiektywu 60X 1,42 NA. Jeśli w kropli oleju widoczne są bąbelki, wyczyść obiektyw i ponownie dodaj olej.
- Umieścić szkiełko z próbką na stoliku i w razie potrzeby odczekać 10 minut, aż komórki osiądą na szkiełku nakrywkowym.
- Zainicjuj program akwizycyjny. Użyj oświetlenia fluorescencyjnego, aby dostosować ostrość, aż będzie widoczny ostry kontur komórki.
nuta: Przez cały czas należy zachować ostrożność, aby zminimalizować narażenie komórek na wzbudzenie fluorescencyjne, aż do faktycznego uzyskania obrazu.
- Można uzyskać skan spiralnej mozaiki, aby wyświetlić podgląd większych obszarów próbki w celu wybrania komórek lub obszarów zainteresowania. Zaleca się stosowanie krótkich czasów naświetlania (1-10 ms) i niskiej mocy wzbudzenia (0,1-1% transmisji) podczas skanowania próbki lub wyszukiwania celów.
- Zidentyfikuj autofagosomy za pomocą fluorescencji GFP-LC3. Zidentyfikuj lizosomy za pomocą anty-LAMP Alexa Fluor 555 (białko błonowe związane z lizosomami) i jąder komórkowych za pomocą DAPI (utrwalone próbki).
- Wybierz warunki eksperymentalne, w tym długość fali wzbudzenia, obszar obrazu (np. 512x512), grubość stosu, czas ekspozycji i procent transmisji laserowej. W przypadku obrazów o wysokiej rozdzielczości upewnij się, że opcja oświetlenia strukturalnego jest włączona. W przypadku mikroskopii dekonwolucyjnej na OMX wybierz opcję konwencjonalnego oświetlenia.
- Aby uzyskać najlepsze wyniki rekonstrukcji, należy wybrać warunki eksperymentalne tak, aby maksymalna intensywność wynosiła od 10 000 do 15 000 podczas akwizycji. Jeśli problemem jest fotowybielanie, można zastosować obrazowanie przy niższej ekspozycji (liczba od 5 000 do 10 000). Idealnie byłoby, gdyby liczba nie zmniejszyła się o więcej niż dwukrotny czynnik podczas całego przejęcia i należy unikać spadków o więcej niż czterokrotny czynnik. W razie potrzeby zmniejsz grubość stosu, aby zapewnić stałą liczbę intensywności. Kamera nasyca się na poziomie 64 000 zliczeń, więc maksymalna intensywność nigdy nie powinna tego przekraczać. W przypadku dobrych próbek stwierdziliśmy, że warunki eksperymentalne to czas ekspozycji 10 ~ 50 ms z 1% transmisją laserową. Preferowane są jasne i fotostabilne próbki, które można wielokrotnie obrazować. W przypadku zdjęć poklatkowych o wysokiej rozdzielczości wymagana jest stabilna plama.
- Aby zredukować szumy, zalecana jest prędkość odczytu 95 MHz (opcja średniej prędkości) i czas akwizycji wynoszący 2 ms lub więcej. Na zrekonstruowanym obrazie uzyskuje się zwiększoną ilość artefaktów, gdy próbka porusza się podczas akwizycji. Ze względu na ten efekt krótkie ekspozycje są zalecane w przypadku komórek nieprzylegających lub szybko poruszających się.
- Obrazowanie wielokanałowe może być wykonywane jednocześnie lub sekwencyjnie. Tryb sekwencyjny daje mniej przesłuchów i dlatego jest zalecany.
- Aby zmniejszyć fotowybielanie, ogólnie zaleca się obrazowanie najpierw za pomocą dłuższych fal wzbudzenia (532 nm, 488 nm, a następnie 410 nm). Jednak w przypadku wyników eksperymentalnych pokazanych na rysunku 1 kolejność ta została odwrócona (tj. 48 nm, 532 nm i 410 nm) ze względu na fotostabilność tej konkretnej próbki.
- Ustaw górną/dolną granicę stosu Z, przesuwając stolik mikroskopu, aż górna/dolna część komórek będzie nieco nieostra. Żądana odległość między każdym obrazem powinna być utrzymywana na stałym poziomie 0,125 μm dla obrazowania w superrozdzielczości, ponieważ oprogramowanie do rekonstrukcji przyjmuje tę wartość domyślnie.
- Rekonstruuj stosy obrazów za pomocą SoftWorX (Applied Precision, WA) i analizuj za pomocą VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
