Ekstrakcja białek i proteoliza: metoda pozyskiwania białek z próbek tkanki guza prostaty i ich enzymatycznego trawienia do peptydów

Streszczenie

Źródło: Cheng, L. C. et al. Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z ilościową spektrometrią mas bez znaczników w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę ekstrakcji i trawienia białek w celu uzyskania peptydów z tkanki guza prostaty. Peptydy te, po dalszej analizie, mogą pomóc w identyfikacji nowych celów onkoterapii.

Protokół

1. Ekstrakcja białka

1. Przygotować bufor do lizy (Tabela 1). (Objętość zależy od liczby próbek do pobrania.)
2. Pobieranie tkanek
   1. Zważ guz i dodaj 2 ml lodowatego buforu do lizy na każde 100 mg tkanki w probówce do hodowli. (Zazwyczaj potrzeba od 50 do 150 mg mokrej masy tkanki).
3. Homogenizować lizat za pomocą homogenizatora ręcznego lub stacjonarnego (impuls 2x przez 15 s). Wyczyść homogenizator przed pierwszą próbką i między próbkami, używając kolejno 10% wybielacza, 70% etanolu i wody dejonizowanej.
4. W celu redukcji i alkilacji należy podgrzewać homogenizowane próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Następnie schładzaj je na lodzie przez 15 minut. Na lodzie należy poddać sonikację lizatu 3x (tj. pulsować przez 30 s z 60-sekundowymi przerwami między impulsami). W tym momencie próbka nie powinna być lepka ani grudkowata. Podgrzewać lizat w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
5. Odwirować lizat w tej samej probówce do sonikacji za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego o temperaturze 3 500 x g w temperaturze 15 °C przez 15 minut. Zebrać supernatant i wyrzucić osad.
6. Określ stężenie białka, wykonując test Bradforda. W razie potrzeby rozcieńczyć lizat do 5 mg/ml za pomocą buforu do lizy. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C i wykorzystać do dalszej analizy.

2. Trawienie lizatem

.

1. Rozcieńczyć próbkę 12-krotnie, używając 100 mM Tris (pH = 8,5) w celu zmniejszenia ilości guanidyny. Rozcieńczyć wszystkie próbki do tej samej objętości, aby zminimalizować skutki nierównomiernego trawienia. Zaoszczędź 12,5 μg niestrawionego lizatu, aby potwierdzić to na żelu barwionym Coomassie.
2. Aby uzyskać 5 mg białka, dodaj 10 μg endopeptydazy lizylowej (Lys-C) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5-6 godzin. Dostosuj pH do 8,0, dodając 1 M niemiareczkowany Tris (pH ~11).
3. Przygotować 1 mg/ml trypsyny poddanej działaniu L-1-tozyloamido-2-fenyloetylochlorometylowego ketonu (TPCK) w 1 mM HCl (z 20 mM CaCl₂). Dodać trypsynę w stosunku 1:100 trypsyna do białka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
4. Dodaj taką samą ilość świeżej trypsyny, jak w kroku 2.3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
5. Zaoszczędź 12,5 μg strawionego lizatu, aby potwierdzić całkowite trawienie na żelu barwionym Coomassie.

3. Ekstrakcja z odwróconą fazą

1. Zapisz objętość lizatu. Przefiltrować próbkę za pomocą filtra odcinającego o pojemności 15 ml i stężeniu 10 kDa. Odwirować próbkę o masie 3 500 x g za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego (lub 3 500 x g w wirniku o stałym kącie nachylenia) w temperaturze 15 °C do momentu, gdy objętość retentatu będzie mniejsza niż 250 μl (trwa to około 45-60 minut). Zebrać przepływ i wyrzucić retentat.

Tabela 1: i roztwory.Poniższa tabela przedstawia składy i roztworów stosowanych w tym protokole.

bufor	głośność	kompozycja
6 M bufor do lizy chlorku guanidyny	50 ml	6 M chlorek guanidyny, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM fosforowodór tris (2-karboksyetylo), 40 mM chloroacetamid, 2 mM ortowanadan sodu, 2,5 mM pirofosforan sodu, 1 mM β-glicerofosforan, 500 mg n-oktyloglikozyd, ultraczysta woda do objętości
100 mM pirofosforanu sodu	50 ml	2,23 g dekahydratu pirofosforanu sodu, ultra czysta woda do objętości
1M β-glicerofosforan	50 ml	15,31 g β-glicerofosforanu, ultra czysta woda do objętości
5% kwas trifluorooctowy	20 ml	Dodaj 1 ml 100% kwasu trifluorooctowego do 19 ml ultraczystej wody
0,1% kwas trifluorooctowy	250 ml	Dodaj 5 ml 5% kwasu trifluorooctowego do 245 ml ultraczystej wody
Bufor elukcyjny pY	250 ml	0,1% kwas trifluorooctowy, 40% acetonitryl, ultra czysta woda do objętości
Bufor elucyjny pST	250 ml	0,1% kwas trifluorooctowy, 50% acetonitryl, ultra czysta woda do objętości
Bufor powiązań IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM chlorek sodu, ultraczysta woda do objętości
25 mM wodorowęglan amonu, pH 7,5	10 ml	Rozpuścić 19,7 mg w 10 ml sterylnej ultraczystej wody o pH do 7,5 w 1 N kwasie solnym (~10-15 μL/10 ml roztworu), przygotować świeże
1M bufor fosforanowy, pH 7	1 000 ml	423 ml 1 M diwodorofosforan sodu, 577 ml 1 M wodorofosforan sodu
Bufor równowagi	14 ml	6,3 ml acetonitrylu, 280 μl 5% kwasu trifluorooctowego, 1740 μl kwasu mlekowego, 5,68 ml ultraczystej wody
Bufor płuczący	20 ml	9 ml acetonitrylu, 400 μl 5% kwasu trifluorooctowego, 10,6 ml ultraczystej wody
Rozwiązanie do spektrometrii mas	10 ml	500 μL acetonitrylu, 200 μL 5% kwasu trifluorooctowego, 9,3 ml ultraczystej wody
Bufor A	250 ml	5 mM fosforan monopotasowy (pH 2,65), 30% acetonitryl, 5 mM chlorek potasu, ultraczysta woda do objętości
Bufor B	250 ml	5 mM fosforan monopotasowy (pH 2,65), 30% acetonitryl, 350 mM chlorek potasu, ultraczysta woda do objętości
0,9% wodorotlenek amonu	10 ml	300 μL 29,42% wodorotlenku amonu, 9,7 ml ultraczystej wody

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zamrażarka o bardzo niskiej temperaturze	Panasonic	MDF-U76V
Zamrażarka -20 °C	Firma VWR	SCPMF-2020
Łyżka z wirnikiem obrotowym	ThermoFisher Naukowy	75004377
Rotator typu end-over-end	ThermoFisher Naukowy	415110Q
Rurki Eppendorfa o niskim stopniu wiązania z białkami	Eppendorf	22431081
Trypsyna, poddana działaniu TPCK	Worthington Biochemicals	LS003740
Endopeptydaza lizylowa	Wako Pure Chemical Industries, Sp. z o.o.	Numer katalogowy: 125-05061
Woda MilliQ			woda dejonizowana używana do przygotowania wszystkich roztworów i
Dysmubrator dźwiękowy	Fisher Naukowy	FB-120	Sonifikacji
System Polytron PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	Homogenizator

powiedział: powiedział: