Oczyszczanie peptydów: technika ekstrakcji peptydów z trawionych lizatów białkowych oparta na RP-HPLC

Streszczenie

Źródło: Cheng, L. C. et al. Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z ilościową spektrometrią mas bez znaczników w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami do oczyszczania peptydów z mieszaniny strawionych lizatów białkowych. Te oczyszczone peptydy są następnie liofilizowane i przechowywane do dalszych zastosowań. Analiza peptydów może pomóc w zrozumieniu mechaniki związanej z sygnalizacją komórkową i rakiem.

Protokół

1. Ekstrakcja z odwróconą fazą

1. Zacznij od wstępnie strawionego lizatu białkowego w szklanej fiolce. Przefiltrować próbkę za pomocą filtra odcinającego o pojemności 15 ml i stężeniu 10 kDa. Odwirować próbkę o stężeniu 3 500 x g za pomocą obrotowego wirnika kubełkowego (lub 3 500 x g w przypadku wirnika o stałym kącie nachylenia) w temperaturze 15 °C do momentu, gdy objętość retentatu będzie mniejsza niż 250 μl (trwa to około 45 - 60 minut). Zebrać przepływ i wyrzucić retentat.
   NOTE: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C w celu późniejszego wykorzystania.
2. Aby zakwasić próbkę, dodać około 20 μl 5% kwasu trifluorooctowego (TFA) na ml lizatu. Dobrze je wymieszaj i zmierz pH próbki za pomocą pasków pH. Dostosuj pH do 2,5 za pomocą 5% TFA.
3. Podłącz krótszy koniec kolumny C-18 do kolektora próżniowego. Ustaw podciśnienie w zakresie od 17 do 34 kPa (lub zgodnie z instrukcjami producenta). Za pomocą szklanych pipet zwilż kolumnę 3 ml 100% acetonitrylu (ACN). Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
4. Za pomocą szklanych pipet zrównoważyć kolumnę z 6 ml 0,1% TFA nałożonymi jako 2x 3 ml. Zakwaszoną próbkę załadować do kolumny. Nie dodawaj jednorazowo więcej niż 3 ml. Dostosuj podciśnienie, aby celować w około 1 do 2 kropli na sekundę.
5. Za pomocą szklanych pipet przemyć kolumnę 9 ml 0,1% TFA w postaci 3 x 3 ml. Eluować kolumnę za pomocą 2 ml 40% ACN, 0,1% TFA. Zebrać dwie frakcje o pojemności 2 ml do szklanych probówek hodowlanych. Odrzuć kolumnę.
6. Przykryj probówki eluacyjne parafilmem i przebij 3-5 otworów w pokrywie za pomocą igły 20G. Zamrażać eluat na suchym lodzie przez co najmniej 30 minut, aż całkowicie zastygnie.
7. Liofilizuj frakcje przez noc. Następnego dnia upewnij się, że próbki są całkowicie suche przed zatrzymaniem liofilizatora. Przechowywać probówki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z delikatnymi chusteczkami w temperaturze -80 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zamrażarka o bardzo niskiej temperaturze	Panasonic	MDF-U76V
Zamrażarka -20 °C	Firma VWR	SCPMF-2020
Łyżka z wirnikiem obrotowym	ThermoFisher Naukowy	75004377
Kolektor próżniowy	Restek	Numer katalogowy: 26080
Liofilizator	Labconco	7420020
Stołowy koncentrator próżniowy CentriVap	Labconco	7810010
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Rotator typu end-over-end	ThermoFisher Naukowy	415110Q
Szklane probówki hodowlane	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 14-961-26
Parafilm	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 13-374-12
Igła 20G	Bd	B305175
Chusteczki Kimwipes	Fisher Naukowy	06-666A
Rurka z zakrętką	ThermoFisher Naukowy	379189
Probówki stożkowe Nunc 15 ml	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-565-268
Rurki Eppendorfa o niskim stopniu wiązania z białkami	Eppendorf	22431081
Strzykawka 3 ml	Bd	309657
Kwas trifluoroctowy (TFA)	Fisher Naukowy	Przekaźnik PI-28904
Acetonitryl (ACN)	Fisher Naukowy	A21-1
Woda MilliQ			Woda dejonizowana używana do przygotowania wszystkich roztworów i