Wzbogacanie fosfopeptydów: technika immunoprecypitacji oparta na przeciwciałach w celu oddzielenia specyficznych fosforylowanych peptydów od złożonych mieszanin peptydowych

Streszczenie

Źródło: Cheng, L. C., et al. Wzbogacanie fosfopeptydów w połączeniu z ilościową spektrometrią mas bez znaczników w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty. J. Vis. Exp. (2018).

W tym filmie pokazujemy immunologiczne wytrącanie fosfopeptydów z mieszaniny peptydów na podstawie przeciwciał. Wzbogacone fosfopeptydy są zagęszczane próżniowo i przechowywane do dalszej analizy.

Protokół

1. Immunoprecypitacja i wzbogacanie peptydów pY

1. Zawiesić liofilizowany proszek oczyszczonych peptydów trawiennych z 0,5 ml lodowatego buforu wiążącego immunoprecypitację (IP) w każdej frakcji. Połączyć frakcje, przenosząc objętość 0,5 ml do refuzji z drugiej frakcji do pierwszej frakcji i oszczędzając końcówkę pipety. Energicznie wirować (zamiast pipetować w górę iw dół), aby upewnić się, że próbka jest całkowicie rozpuszczona przed przeniesieniem jej do krioprobówki z zakrętką o pojemności 3,6 ml.
2. Przepłukać probówki liofilacyjne kolejnym 0,5 ml buforu wiążącego IP (Tabela 1) w każdej probówce. Przenieś roztwór do zakrętki o pojemności 3,6 ml za pomocą tej samej końcówki pipety, aby zminimalizować straty próbki. Powtórzyć płukanie jeszcze 1 raz, sprawiając, że końcowa objętość zawiesiny wynosi 2 ml (na 5 mg białka). Zmierz pH próbki, aby upewnić się, że wynosi około 7,4. Jeśli jest zbyt kwaśny, stopniowo dodaj 10 μL 1M Tris (niemiareczkowany, pH ~11). Jeśli jest zbyt zasadowy, należy dodać 10 μl rozcieńczonego HCl (1:25 lub 1:100).
3. Umyj wstępnie kulki pY (na 5 mg początkowego lizatu)
   1. Na próbkę potrzeba 25 μg przeciwciała 4G10 i 12,5 μg przeciwciała 27B10.4. Po użyciu pipety p200 z naciętą końcówką do przeniesienia przeciwciał do oddzielnych probówek do mikrowirówek, przemyj przeciwciała 450 μl lodowatego buforu wiążącego IP 2x. Odwirować je przy sile 100 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odessać sklarowany nad osadem.
   2. Zawiesić kulki do stężenia podstawowego 0,5 mg/ml za pomocą buforu wiążącego IP. (Nie obracaj koralików.) Po przeniesieniu niezbędnej zawiesiny (50 μl zawiesiny przeciwciał 4G10 i 25 μl zawiesiny przeciwciał 27B10,4 na próbkę) do pojedynczej probówki, należy odwirować podstawowe probówki wirówkowe o masie 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Umyć ścianki boczne supernatantem przed powrotem koralików do przechowywania w lodówce.
4. Dodaj wstępnie umyte kulki pY do zawieszonego roztworu próbki w krioprobówkach z nakrętką śrubową. Inkubować je w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end przez noc.
5. Umieść zakrętki krioprobówek w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wyłożonej delikatną chusteczką. Odkręcaj koraliki w odległości 100 x g przez 1 min. Zachowaj supernatant, który zostanie użyty do wzbogacenia peptydów pST.
6. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 300 μl bufora wiążącego IP. Przenieść je do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i wirować w temperaturze 100 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
7. Przepłukać probówkę inkubacyjną 3x 200 μl buforu wiążącego IP. Za każdym razem przenosić zawartość do tej samej probówki mikrowirówkowej. Następnie obróć je w dół.
8. Umyj kulki w probówce do mikrowirówek 3x 500 μl buforu wiążącego IP i odwiruj je w tempie 100 x g przez 1 min. Następnie umyj kulki 4x 450 μl 25 mM NH₄HCO₃, pH 7,5 i odwiruj je w 100 x g przez 1 minutę. Za każdym razem używaj świeżego 25 mM roztworu NH₄HCO₃ z proszku.
9. Odwirować kulki o sile 1 500 x g przez 1 minutę. Użyj końcówki do ładowania żelem, aby całkowicie usunąć supernatant, zanurzając końcówkę końcówki ładującej żel nieco poniżej powierzchni kulek.
10. Dodać 4 razy objętość kulki 0,1% TFA do kulek (tj. dodać 300 μl 0,1% TFA na 75 μg zawiesiny kulki pY). Dobrze je wymieszać i inkubować mieszaninę w termomikserze z prędkością 1 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
11. Przenieść zawiesinę do filtra wirowego o średnicy 0,2 μm. Szybko odwirować probówkę elucyjną i przenieść pozostałą objętość do tego samego filtra wirowego za pomocą pipety P10. Obracaj filtr wirowy przy 850 x g przez 1 minutę. Przenieść elucję do probówki mikrowirówkowej o niskim poziomie wiązania białek. Zagęścić eluat próżniowo do sucha przez noc w temperaturze 40 °C i czasie ogrzewania 300 min.
    nuta: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Zamrozić próbki w temperaturze -80 °C i kontynuować w późniejszym terminie.

Tabela 1: i roztwory.Poniższa tabela przedstawia składy i roztworów stosowanych w tym protokole.

bufor	głośność	kompozycja
6 M Bufor do lizy chlorku guanidyny	50 ml	6 M chlorek guanidyny, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM fosforowodór tris (2-karboksyetylo), 40 mM chloroacetamid, 2 mM ortowanadan sodu, 2,5 mM pirofosforan sodu, 1 mM β-glicerofosforan, 500 mg n-oktyloglikozyd, ultraczysta woda do objętości
100 mM pirofosforan sodu	50 ml	2,23 g dekahydratu pirofosforanu sodu, ultra czysta woda do objętości
1M β-glicerofosforan	50 ml	15,31 g β-glicerofosforanu, ultra czysta woda do objętości
5% kwas trifluorooctowy	20 ml	Dodaj 1 ml 100% kwasu trifluorooctowego do 19 ml ultraczystej wody
0,1% Kwas trifluorooctowy	250 ml	Dodaj 5 ml 5% kwasu trifluorooctowego do 245 ml ultraczystej wody
Bufor elukcyjny pY	250 ml	0,1% kwas trifluorooctowy, 40% acetonitryl, ultra czysta woda do objętości
Bufor elucyjny pST	250 ml	0,1% kwas trifluorooctowy, 50% acetonitryl, ultra czysta woda do objętości
Bufor powiązań IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM chlorek sodu, ultraczysta woda do objętości
25 mM wodorowęglan amonu, pH 7,5	10 ml	Rozpuścić 19,7 mg w 10 ml sterylnej ultraczystej wody o pH do 7,5 w 1 N kwasie solnym (~10-15 μL/10 ml roztworu), przygotować świeże
1M bufor fosforanowy, pH 7	1 000 ml	423 ml 1 M diwodorofosforan sodu, 577 ml 1 M wodorofosforan sodu
Bufor równowagi	14 ml	6,3 ml acetonitrylu, 280 μl 5% kwasu trifluorooctowego, 1740 μl kwasu mlekowego, 5,68 ml ultraczystej wody
Bufor płuczący	20 ml	9 ml acetonitrylu, 400 μl 5% kwasu trifluorooctowego, 10,6 ml ultraczystej wody
Rozwiązanie do spektrometrii mas	10 ml	500 μL acetonitrylu, 200 μL 5% kwasu trifluorooctowego, 9,3 ml ultraczystej wody
Bufor A	250 ml	5 mM fosforan monopotasowy (pH 2,65), 30% acetonitryl, 5 mM chlorek potasu, ultraczysta woda do objętości
Bufor B	250 ml	5 mM fosforan monopotasowy (pH 2,65), 30% acetonitryl, 350 mM chlorek potasu, ultraczysta woda do objętości
0,9% Wodorotlenek amonu	10 ml	300 μL 29,42% wodorotlenku amonu, 9,7 ml ultraczystej wody

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Liofilizator	Labconco	7420020
Stołowy koncentrator próżniowy CentriVap	Labconco	7810010
Chusteczki Kimwipes	Fisher Naukowy	06-666A
Filtr wirowy Millipore 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Rurki Eppendorfa o niskim stopniu wiązania z białkami	Eppendorf	22431081
antyfosfotyrozyna, agaroza, klon: 4G10	Millipore Sigma	Numer katalogowy: 16101
Przeciwciało 27B10.4	Cytoszkielet	APY03-koraliki
Zestaw do oznaczania peptydów	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 23275
Wskazówka	PolyLC Inc	TT200TIO,96
Kolumny SCX (polisulfoetylo A)	PolyLC Inc	SPESE1203
Strzykawka 3 ml	Bd	309657
Woda MilliQ			Woda dejonizowana używana do przygotowania wszystkich roztworów i
Kwas trifluoroctowy (TFA)	Fisher Naukowy	Przekaźnik PI-28904
Acetonitryl (ACN)	Fisher Naukowy	A21-1
Chlorek potasu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP366-500
kwas mlekowy	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Wodorotlenek amonu	Fisher Naukowy	A669S-500
Baza Tris	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-5

powiedział: