Wzbogacanie fosfopeptydów na bazie dwutlenku tytanu: metoda selektywnej izolacji fosfopeptydów z biblioteki peptydów

Abstract

Źródło: Cheng, L. C. et al. Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z ilościową spektrometrią mas bez znaczników w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje wzbogacanie fosforeptydów ekstrahowanych z tkanki guza prostaty za pomocą dwutlenku tytanu. Te wzbogacone fosfopeptydy mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak charakterystyka białek, w celu zrozumienia szlaków sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w progresję raka prostaty.

Protocol

1. Wzbogacanie peptydów pY w dwutlenek tytanu

1. Wysuszone fosfopeptydy zawiesić w 200 μl 50% ACN, 0,1% TFA. Wirować i odwirowywać je przy 10 000 x g przez 30 s. Powtórz to 1x, aby dobrze je zawiesić.
2. Przygotowanie kulek TiO₂ zawartych w końcówkach, które mają pojemność na 200 μL próbek.
   1. Delikatnie postukaj w małą stronę końcówki końcówki, aby przesunąć materiał na ten koniec. Opłucz końcówkę, dodając 200 μl 100% ACN, a następnie odwróć końcówkę i potrząśnij małym końcem, aby przesunąć płyn w kierunku nakrętki.
   2. Za pomocą żyletki odetnij mały koniec końcówki i umieść go na probówce o niskim poziomie wiązania białka. (Unikaj używania rurek polistyrenowych, ponieważ TiO₂ przykleja się do boków rury.) Zdejmij nakrętkę i włóż mikropipetę, aby zanurzyć pozostały ACN. Powtórz pranie z 200 μL 100% ACN. Kulki TiO₂ znajdują się teraz w probówce o niskim poziomie wiązania białka w kolejnych krokach.
   3. Kondycjonuj TiO₂ z 500 μL 100% ACN 2x. Pipetować, aby wymieszać kulki z rozpuszczalnikiem. Odwirować je w temperaturze 100 x g przez 1 minutę.
   4. Warunek TiO₂ z 500 μL 0,2 M buforu fosforanu sodu (pH ~7) 2x. Przemyć kulki 300 μL buforu równoważącego 3x. Ponieważ TiO₂ jest bardzo gęsty, koraliki szybko osiadają.
3. Dodać 400 μl 50% ACN, 0,1% TFA do probówki o niskim poziomie wiązania białka, a następnie dodać 84 μl kwasu mlekowego. Przenieść zawieszone fosfopeptydy do probówki o niskim poziomie wiązania białek i inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora koniec nad końcem.
4. Odwiruj kulki o masie 100 x g przez 1 minutę, aby je ogrzać. Przemyć je 300 μl buforu równowagowego (tabela 1) 2x i odwirować w temperaturze 100 x g przez 1 min.
5. Przepłukać kulki 300 μl buforu płuczącego 2x. Przenieść je do filtra wirowego 0,2 μm. Wiruj nimi w rozmiarze 1 500 x g przez 1 min.
6. Przenieś jednostkę filtrującą do czystej probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości białka. Zawartość należy 2x wypłukać 200 μl 0,9% NH₃ w H₂O. Zmierzyć pH za pomocą pasków pH, które powinny wynosić od 10 do 11. Zagęścić próżniowo eluat do wyschnięcia przez noc w celu odparowania amoniaku.

Tabela 1: i roztwory.Poniższa tabela przedstawia składy i roztworów stosowanych w tym protokole.

bufor	głośność	kompozycja
6 M bufor do lizy chlorku guanidyny	50 ml	6 M chlorek guanidyny, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM fosforowodór tris (2-karboksyetylo), 40 mM chloroacetamid, 2 mM ortowanadan sodu, 2,5 mM pirofosforan sodu, 1 mM β-glicerofosforan, 500 mg n-oktyloglikozyd, ultraczysta woda do objętości
100 mM pirofosforanu sodu	50 ml	2,23 g dekahydratu pirofosforanu sodu, ultra czysta woda do objętości
1M β-glicerofosforan	50 ml	15,31 g β-glicerofosforanu, ultra czysta woda do objętości
5% kwas trifluorooctowy	20 ml	Dodaj 1 ml 100% kwasu trifluorooctowego do 19 ml ultraczystej wody
0,1% kwas trifluorooctowy	250 ml	Dodaj 5 ml 5% kwasu trifluorooctowego do 245 ml ultraczystej wody
Bufor elukcyjny pY	250 ml	0,1% kwas trifluorooctowy, 40% acetonitryl, ultra czysta woda do objętości
Bufor elucyjny pST	250 ml	0,1% kwas trifluorooctowy, 50% acetonitryl, ultra czysta woda do objętości
Bufor powiązań IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM chlorek sodu, ultraczysta woda do objętości
25 mM wodorowęglan amonu, pH 7,5	10 ml	Rozpuścić 19,7 mg w 10 ml sterylnej ultraczystej wody o pH do 7,5 w 1 N kwasie solnym (~10-15 μL/10 ml roztworu), przygotować świeże
1M bufor fosforanowy, pH 7	1 000 ml	423 ml 1 M diwodorofosforan sodu, 577 ml 1 M wodorofosforan sodu
Bufor równowagi	14 ml	6,3 ml acetonitrylu, 280 μl 5% kwasu trifluorooctowego, 1740 μl kwasu mlekowego, 5,68 ml ultraczystej wody
Bufor płuczący	20 ml	9 ml acetonitrylu, 400 μl 5% kwasu trifluorooctowego, 10,6 ml ultraczystej wody
Rozwiązanie do spektrometrii mas	10 ml	500 μL acetonitrylu, 200 μL 5% kwasu trifluorooctowego, 9,3 ml ultraczystej wody
Bufor A	250 ml	5 mM fosforan monopotasowy (pH 2,65), 30% acetonitryl, 5 mM chlorek potasu, ultraczysta woda do objętości
Bufor B	250 ml	5 mM fosforan monopotasowy (pH 2,65), 30% acetonitryl, 350 mM chlorek potasu, ultraczysta woda do objętości
0,9% wodorotlenek amonu	10 ml	300 μL 29,42% wodorotlenku amonu, 9,7 ml ultraczystej wody

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kolektor próżniowy	Restek	Numer katalogowy: 26080
Liofilizator	Labconco	7420020
Stołowy koncentrator próżniowy CentriVap	Labconco	7810010
Rotator typu end-over-end	ThermoFisher Naukowy	415110Q
żyletka	Fisher Naukowy	620177
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Probówki stożkowe Nunc 15 ml	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-565-268
Filtr wirowy Millipore 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Rurki Eppendorfa o niskim stopniu wiązania z białkami	Eppendorf	22431081
antyfosfotyrozyna, agaroza, klon: 4G10	Millipore Sigma	Numer katalogowy: 16101
Zestaw do oznaczania peptydów	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 23275
Kwas trifluoroctowy (TFA)	Fisher Naukowy	Przekaźnik PI-28904
Acetonitryl (ACN)	Fisher Naukowy	A21-1
kwas mlekowy	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Wodorotlenek amonu	Fisher Naukowy	A669S-500
Fosforan potasu jednozasadowy	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP362-500
Chlorek potasu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP366-500
Chlorek wapnia dwuwodny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP510-500
Baza Tris	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-5
Końcówka MonoTip	PolyLC Inc	TT200TIO,96