Modelowanie raka prostaty w genetycznie modyfikowanych modelach mysich: technika zlokalizowanej edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach przedniego płata prostaty myszy

Abstract

Źródło: Riedel, M. et al. Wirusowe dostarczanie przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje metodę edycji określonych genów w komórkach gruczołu krokowego za pomocą systemu dostarczania opartego na adenowirusie. Podejście to pozwala na ortotopową i miejscową zmianę ekspresji genów przy użyciu technologii CRISPR do opracowania nowych mysich modeli raka prostaty.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Dostarczanie wirusa do mysiej prostaty

1. Znieczulić zwierzę przez wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27G x 1/2". Stosować dawkę znieczulenia 0,01 ml/g masy ciała. Jeśli zabieg trwa dłużej niż 30 minut, należy zachować znieczulenie, wstrzykując 1/3 dawki początkowej co 30 minut.
2. Zbadaj głębokość znieczulenia, oceniając rozluźnienie mięśni, wycofanie pedału i odruchy powiekowe. Gdy zaobserwuje się utratę odruchów, ogol dolną część brzucha zwierzęcia.
3. Ostrożnie zakryj oczy zwierzęcia weterynaryjną maścią okulistyczną za pomocą sterylnego bawełnianego wacika, aby zapobiec ślepocie z powodu braku odruchu rogówkowego.
4. Przetrzyj ogolony brzuch 70% etanolem i 10% jodowidonem, aby zdezynfekować obszar operacyjny. Wyszoruj obszar operacyjny od środka obszaru operacyjnego w kierunku obrzeża.
5. Wykonaj pionowe nacięcie skóry w dolnej linii środkowej brzucha na wysokości około 1 cm za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych.
6. Podnieś otrzewną za pomocą cienkich kleszczy, aby zapobiec uszkodzeniu narządów leżących pod spodem. Ostrożnie wykonaj nacięcie <8 mm nożyczkami chirurgicznymi przez otrzewną.
   UWAGA: W przeciwieństwie do ludzi, gruczoł krokowy gryzonia składa się z czterech oddzielnych płatów. Płat przedni jest przymocowany do pęcherzyka nasiennego.
7. Delikatnie odsuń tkankę tłuszczową na bok, aby odsłonić pęcherzyk nasienny. Za pomocą kleszczy pierścieniowych ostrożnie podnieś pęcherzyk nasienny, aż będzie można zidentyfikować przednią prostatę (ryc. 1).
8. Wstrzyknąć całkowitą objętość 30 μl roztworu wirusa (3 x 10¹⁰ cząstek wirusa) w przedni nabłonek gruczołu krokowego za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml z igłą 30 G x 8 mm. Zminimalizuj wyciek i upewnij się, że płyn został wchłonięty w tkance, tworząc mały pęcherzyk. Umieść pęcherzyk nasienny z powrotem w jamie brzusznej.
9. Zszyj otrzewną za pomocą 2-3 prostych przerywanych szwów za pomocą 6-0 wchłanialnych szwów z igłą 13 mm, 3/8 i igłą stożkową.
10. Zszyj skórę trzema sterylnymi klipsami o wymiarach 4,8 x 6,5 mm, unosząc skórę kleszczami, aby uniknąć uszkodzenia otrzewnej.
11. W celu lepszej rekonwalescencji należy zastosować antidotum na znieczulenie w dawce 0,01 ml/g masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27G x 1/2". Ostrożnie umieść zwierzę z powrotem w klatce.

Results

Rysunek 1: Ilustracja procedury. Zabieg przeprowadza się na myszy Rosa26-LSL-Cas9-EGFP wygenerowanej przez Platt i wsp. Przednia prostata (AP) jest połączona z pęcherzykiem nasiennym (SV). Cząsteczki wirusa wykazujące ekspresję przewodnika RNA i białko Cre są wstrzykiwane do przedniej części prostaty w celu zmiany ekspresji genów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J myszy	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy: 26175
Strzykawka insulinowa 0,5 ml U-100	Bd	324825	do wstrzykiwania wirusa
Strzykawka 1 ml	Bd	300013	do iniekcji znieczulenia
Igła 30 G 1/2''	Bd	304000	do iniekcji znieczulenia
6-0 Szew Polysorb	Firma Medtronic	Zobacz materiał GL889	aby zamknąć otrzewną
Jednorazowa sterylizowana serweta chirurgiczna	wielu dostawców
Poduszka grzewcza	wielu dostawców
Podkładka przygotowawcza powidonowo-jodowa	Fisher Naukowy	06-669-70
Maszyna do przycinania	Aesculap	GT415	do golenia brzucha
Kleszcze Dumonta	F.S.T	Numer katalogowy: 11252-00
Uchwyt na mikroigłę Halsey	F.S.T	Numer katalogowy: 12500-12
Nożyczki do tęczówki	F.S.T	Numer katalogowy: 14094-11
Kleszcze o wąskim wzorze	F.S.T	Numer katalogowy: 11002-12
Kleszcze pierścieniowe	F.S.T	Numer katalogowy: 11106-09
Uchwyt systemu klipsów do nawijania w zestawie Klipy	F.S.T	Numer katalogowy 12030-01	aby zamknąć skórę
Środek do usuwania systemu klipsów do ran	F.S.T	Numer katalogowy: 12030-04
1x PBS (Biblioteka PBS)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 10010-023
Antysedan			uzyskane z zakładu zwierzeń
Butorfanol			uzyskane z zakładu zwierzeń
Chlorowodorek medetomidyny			uzyskane z zakładu zwierzeń
Midazolam			uzyskane z zakładu zwierzeń
100% etanol	Fisher Naukowy	22-032-103
Maść do oczu	Takeda powiedział:	7242
Wirus (AAV, AV)	wielu dostawców		Wirus używany w tym protokole jest własnej produkcji