Makrodysekcja tkanki nowotworowej FFPE: technika uzyskiwania określonej tkanki nowotworowej z niebarwionych próbek

Streszczenie

Źródło: Sugimoto, K. et al. Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje metodę ręcznego makrodysekcji tkanki rakowej z niebarwionych próbek tkanek w celu uzyskania określonej tkanki nowotworowej. Wycinek tkanki może być dalej przetwarzany w celu uzyskania DNA do badań całego genomu nad nowotworami przewodu pokarmowego.

Protokół

1. Skrobanie slajdów

1. Przygotować bufor do wytrawiania/lizy z 650 ml wody poddanej działaniu dietylowęglanu (DEPC), 100 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 50 ml chlorowodorku Tris (Tris-HCL) 2 M pH 8,8 i 200 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) (patrz tabela materiałów).
2. Napełnij jednorazową probówkę polipropylenową o pojemności 1,5 ml 80 μl buforu do wytrawiania/lizy (patrz tabela materiałów).
3. Włóż czystą końcówkę pipety do bufora.
4. Zidentyfikuj tkanki rakowe w obszarze guza najbardziej odpowiednie do makrodysekcji zgodnie z odpowiednim przekrojem wybarwionym H&E.
5. Makropreparuj tkankę nowotworową na podstawie zaznaczonego przekroju wybarwionego H&E.
   1. Weź czystą żyletkę i delikatnie zeskrob tkankę rakową ze szkiełka, starając się utrzymać ją w jednym kawałku, aby łatwiej było z nią pracować.
   2. Wyjąć końcówkę pipety z jednorazowej probówki polipropylenowej zawierającej bufor i użyć jej do przeniesienia zeskrobowanej tkanki do fiolki z buforem (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Mokra końcówka powinna przyciągać tkankę, co ułatwia transfer.
6. Powtórz krok 1.5 z pozostałymi slajdami.
7. Po tym, jak cała tkanka znajdzie się w jednorazowej tubie polipropylenowej, użyj końcówki, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona i nie przykleja się do ścianki tuby.
8. Dodać 20 μl proteazy serynowej związanej z subtylizyną do fiolki i delikatnie strzepnąć, aby wymieszać (patrz tabela materiałów).
9. Umieścić fiolkę w bloku grzewczym o temperaturze 55 °C na co najmniej 4 godziny lub na noc. Upewnij się, że po 2 godzinach lekko wirujesz.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% dodecylosiarczan sodu (SDS)	Jakość Biologiczna	351-032-721 EA
Woda uzdatniona metodą DEPC	Jakość Biologiczna	tel. 351-068-131
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Corning	46-034-CL
Chlorowodorek trisu (Tris-HCL) 2 M pH 8,8	Jakość Biologiczna	tel. 351-092-101
Proteinaza K	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał P8107S
Jednorazowa tuba polipropylenowa (Eppendorf)	Eppendorf	24533495