$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Leczenie wodorosiarczynem
- Jako próbkę należy użyć 45 μl strawionego roztworu tkankowego.
- Zabieg wodorosiarczynowy należy wykonać przy użyciu odczynników w zestawie do konwersji wodorosiarczynu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
- Dodać 5 μl buforu rozcieńczającego do próbki DNA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut (patrz tabela materiałów).
- Podczas inkubacji próbek należy przygotować odczynnik do konwersji wodorosiarczynu, dodając 750 μl dH2O i 210 μl buforu rozcieńczającego do jednej probówki odczynnika do konwersji CT (patrz tabela materiałów). Mieszaj probówki, wirując przez 10 minut.
- Po 15 minutowej inkubacji dodać 100 μl przygotowanego odczynnika konwersji CT do każdej próbki i wymieszać przez inwersję.
- Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze 50 °C przez 12–16 godzin.
- Po inkubacji wyjąć próbki i umieścić je na lodzie na 10 minut.
- Dodać 400 μl buforu wiążącego i wymieszać każdą próbkę, pipetując w górę i w dół (patrz tabela materiałów). Załaduj każdą próbkę do kolumny wirującej i umieść kolumnę w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml (patrz Tabela materiałów).
- Odwirować każdą próbkę z pełną prędkością (10 000 x g) przez 1 minutę i odrzucić przepływ.
- Dodać 200 μl buforu do przemywania do każdej kolumny i wirować z pełną prędkością przez 1 minutę, odrzucając przepływ (patrz tabela materiałów).
- Dodać 200 μl buforu odsiarczającego do każdej kolumny i pozostawić kolumnę w temperaturze pokojowej na 15 minut (patrz tabela materiałów). Po inkubacji obracać kolumny z pełną prędkością przez 1 minutę i odrzucić przepływ.
- Dodać 200 μl buforu do płukania do każdej kolumny i wirować z pełną prędkością przez 1 minutę (patrz tabela materiałów).
- Powtórz ten krok jeszcze raz.
- Dodać 46 μl dH2O do każdej kolumny i umieścić każdą kolumnę w nowej sterylnej probówce polipropylenowej jednorazowego użytku o pojemności 1,5 ml (patrz tabela materiałów). Obracaj każdą probówkę przez 2 minuty, aby wymyć DNA.
- Wyjmij każdą kolumnę wirującą z jednorazowej rurki polipropylenowej i wyrzuć (patrz Tabela materiałów). DNA jest teraz gotowe do analizy.
2. Ilościowy PCR specyficzny dla metylacji (qMSP)
- Użyj zmodyfikowanego wodorosiarczynem DNA z kroku 1.3 jako matrycy do fluorescencji PCR w czasie rzeczywistym w qMSP, aby ocenić metylację regionu promotora w każdej analizie genów.
- Wykonaj qMSP za pomocą 96-dołkowego instrumentu Real-Time PCR (patrz tabela materiałów).
- Sprawdź status metylacji promotora genu docelowego w DNA zmodyfikowanym wodorosiarczynem za pomocą sond startera do przodu 200 nM, startera odwrotnego 200 nM i sondy 80 nM. Przygotować mieszaninę wzorcową z 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-merkaptoetanolu, 10 nM fluoresceiny, 0,166 mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu i 0,04 U/μl polimerazy DNA (patrz tabela materiałów). Końcowa objętość reakcyjna w każdym studzience dla wszystkich testów wynosi 25 μl.
- Wykonaj cykl qMSP w następujący sposób: 95 °C przez 5 minut, a następnie 55 cykli 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 minutę
UWAGA: Gen docelowy powinien być wybrany na podstawie kryteriów o większych wartościach beta, spokrewnieniu z wyspami CpG w regionie promotora i odpowiednim do projektowania startera i sondy dla qMSP.
- Użyj genomu ludzkiego poddanego działaniu metylazy CpG (M.SssI) jako dodatniej kontroli metylacji (patrz tabela materiałów).
nuta: Końcowa kwantyfikacja metylacji jest definiowana jako względna wartość metylacji (RMV) i obliczana jako 2–ΔΔCt dla każdej kontrpróby wykrycia metylacji w porównaniu ze średnią Ct dla β-aktyny (ACTB). Sekwencje starterów i sond przedstawiono w tabeli 1. Dla niewykrytych kontrprób stosuje się wartość Ct równą 100, co daje wartość 2–ΔΔCt bliską zeru. Stosuje się następujący wzór:
średnia 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.
| gen | Do przodu 5' - 3' | Bieg wsteczny 5' - 3' | Sondy |
| B-AKTYNA | TAG: GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA, AAA, ATC, CCG, ACG, AAC, GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |