Kriokonserwacja oparta na witryfikacji: ultraszybka technika chłodzenia służąca do przechowywania próbek biologicznych w bardzo niskich temperaturach w celu długotrwałego przechowywania

Streszczenie

Źródło: Lu, J. H. et al. Ustanowienie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka i pierwotnych linii komórkowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie demonstrujemy ultraszybką metodę kriowitryfikacji do konserwacji próbek biologicznych. Metoda polega na zastosowaniu kombinacji krioprotektantów w celu ochrony tkanki biologicznej przed uszkodzeniem przez zamarzanie poprzez zapobieganie tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Kriokonserwacja tkanek

UWAGA: Ta część odnosi się głównie do metod stosowanych w zestawie Cryo Kit do żywych tkanek. Główne zestawy i wyposażenie są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Poddaj myszy eutanazji metodą zatwierdzoną przez IRB, gdy guz ma średnicę większą niż 10 mm.
2. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek powoli izoluj guz od myszy.
3. Umyj tkanki nowotworowe za pomocą DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm. Wypreparuj i usuń martwicze obszary, tkankę tłuszczową, skrzepy krwi i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek.
4. Wytnij tkanki nowotworowe do maksymalnej grubości 1 mm za pomocą formy.
5. Umyj plastry z DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm.
   nuta: Proces witryfikacji polega na użyciu probówek oznaczonych V1/V2/V3 w krokach 1.6-1.8. Głównymi składnikami są DMSO i sacharoza.
6. Przenieść plastry do probówki V1 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę, a następnie umieścić ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.
7. Wlej roztwór V1 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V2 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę V2 w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwiń i odwróć rurkę na krótko, a następnie umieść ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.
8. Wlej roztwór V2 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V3 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę i umieścić ją w temperaturze 4 °C na co najmniej 5 minut. Upewnij się, że wszystkie plastry opadają na dno tuby.
   1. Jeżeli kilka plasterków pozostaje na wodzie, zwinąć i na krótko odwrócić rurkę, a następnie ponownie umieścić probówkę w temperaturze 4 °C, aż wszystkie plastry całkowicie opadną; jeśli to konieczne, wyrzucić pływające plastry
   .
9. Wlej roztwór V3 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm.
10. Przytnij uchwyty na chusteczki na odpowiednią długość i umieść je na sterylnej gazie. Przełóż plastry na uchwyty. Owiń uchwyty gazą i umieść je w ciekłym azocie za pomocą kleszczy, a następnie inkubuj przez 5 minut.
11. Oznacz fiolki kriogeniczne informacjami o tkankach.
12. Przenieś posiadacze z plastrami tkanek do fiolek kriogenicznych, które są przechowywane w ciekłym azocie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw żywych tkanek Zestaw kriogeniczny	Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny	LT2601
Formy do obróbki bibułkowej i ostrza pomocnicze	Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny	LT2603 (wersja angielska
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Basalmedia Technology, Szanghaj, Chiny	L40601

) Klienta