Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja LDN z płukania jamy brzusznej
- Pobieranie próbek
- Wlać 1,000 ml normalnej sterylnej soli fizjologicznej bezpośrednio do jamy brzusznej przed zamknięciem rany u pacjentów, którzy przeszli operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego.
nuta: Próbki uzyskano od pacjentów, którzy przeszli resekcję żołądka, kolektomię lub przełyk bez uprzedzeń ze względu na wiek lub płeć. Sól fizjologiczną przeniesiono do pojemnika i wlano do całego brzucha w ciągu jednej minuty. Jest to rutynowo wykonywane jako pooperacyjne płukanie otrzewnej bez znaczącego wpływu na pacjentów.
- Intensywnie płukać jamę brzuszną przez co najmniej 1 minutę.
nuta: Zaleca się, aby podawany płyn był powoli mieszany rękami chirurga, aby próbki były jednolite.
- Odzyskaj 200 ml płynu do płukania za pomocą czterech strzykawek o pojemności 50 ml.
nuta: Czasami do pobierania płynów używany jest gumowy łącznik .
- Przeprowadzić oczyszczanie LDN otrzewnej za pomocą mAb specyficznego dla granulocytów, CD66b
nuta: Ponieważ warstwa pośrednia po odwirowaniu w gradionym gradimencie gęstości zawiera wiele komórek jednojądrzastych, przeprowadzono pozytywną selekcję polimorficznych neutrofili przy użyciu mAb CD66b.
- Przenieść płyn z płukania otrzewnowej do probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Na tym etapie przepuść płyny przez nylonowy filtr 100 μm, aby usunąć zanieczyszczenia.
- Odwirować płyn otrzewnowy o sile 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
- Ponownie zawiesić granulki w 5 ml PBS z 0,02% EDTA.
- Ostrożnie nałożyć 5 ml zawiesiny komórek na 3 ml roztworu gradientu gęstości.
- Wirować przy 1 700 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez żadnych przerw.
- Zebrać około 2 do 3 ml roztworu zawierającego warstwy pośrednie (ryc. 1A) za pomocą pipety i wymieszać z 10 ml PBS z 0,02% EDTA.
- Odwirować płyn otrzewnowy o sile 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
- Dodać kolejne 10 ml PBS z 0,02% EDTA i odwirować przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
- Rozpuść osad komórkowy (1 x 107) w 60 μl buforu do zestawu do magnetycznej separacji komórek.
- Dodać 20 μl bloku Fc do granulek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać 20 μl anty-CD66b sprzężonego z mikrogranulkami i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przemyć i ponownie zawiesić granulki w 500 μl buforu MACS.
- Zawiesinę komórek nanieść na kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym odpowiedniego separatora magnetycznego i zebrać przepływowe komórki zawierające CD66b(-) poprzez przemycie kolumny 15 ml buforu.
- Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i natychmiast wypłucz magnetycznie oznaczone ogniwa CD66b(+), mocno wciskając tłok do kolumny.
nuta: Populacja komórek CD66b (+) składa się głównie z neutrofili, jak określono w analizie FACS, co wskazuje, że >95% frakcji CD66 (+) jest dodatnich dla CD11b, CD15 i CD16, ale ujemnych dla CD14.
