Izolacja neutrofili o niskiej gęstości otrzewnej: technika uzyskiwania neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja LDN z płukania jamy brzusznej

1. Pobieranie próbek
   1. Wlać 1,000 ml normalnej sterylnej soli fizjologicznej bezpośrednio do jamy brzusznej przed zamknięciem rany u pacjentów, którzy przeszli operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego.
      nuta: Próbki uzyskano od pacjentów, którzy przeszli resekcję żołądka, kolektomię lub przełyk bez uprzedzeń ze względu na wiek lub płeć. Sól fizjologiczną przeniesiono do pojemnika i wlano do całego brzucha w ciągu jednej minuty. Jest to rutynowo wykonywane jako pooperacyjne płukanie otrzewnej bez znaczącego wpływu na pacjentów.
   2. Intensywnie płukać jamę brzuszną przez co najmniej 1 minutę.
      nuta: Zaleca się, aby podawany płyn był powoli mieszany rękami chirurga, aby próbki były jednolite.
   3. Odzyskaj 200 ml płynu do płukania za pomocą czterech strzykawek o pojemności 50 ml.
      nuta: Czasami do pobierania płynów używany jest gumowy łącznik
   .
2. Przeprowadzić oczyszczanie LDN otrzewnej za pomocą mAb specyficznego dla granulocytów, CD66b
   nuta: Ponieważ warstwa pośrednia po odwirowaniu w gradionym gradimencie gęstości zawiera wiele komórek jednojądrzastych, przeprowadzono pozytywną selekcję polimorficznych neutrofili przy użyciu mAb CD66b.
   1. Przenieść płyn z płukania otrzewnowej do probówki o pojemności 50 ml.
      nuta: Na tym etapie przepuść płyny przez nylonowy filtr 100 μm, aby usunąć zanieczyszczenia.
   2. Odwirować płyn otrzewnowy o sile 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Ponownie zawiesić granulki w 5 ml PBS z 0,02% EDTA.
   4. Ostrożnie nałożyć 5 ml zawiesiny komórek na 3 ml roztworu gradientu gęstości.
   5. Wirować przy 1 700 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez żadnych przerw.
   6. Zebrać około 2 do 3 ml roztworu zawierającego warstwy pośrednie (ryc. 1A) za pomocą pipety i wymieszać z 10 ml PBS z 0,02% EDTA.
   7. Odwirować płyn otrzewnowy o sile 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   8. Dodać kolejne 10 ml PBS z 0,02% EDTA i odwirować przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
   9. Rozpuść osad komórkowy (1 x 10⁷) w 60 μl buforu do zestawu do magnetycznej separacji komórek.
   10. Dodać 20 μl bloku Fc do granulek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   11. Dodać 20 μl anty-CD66b sprzężonego z mikrogranulkami i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 4 °C.
   12. Przemyć i ponownie zawiesić granulki w 500 μl buforu MACS.
   13. Zawiesinę komórek nanieść na kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym odpowiedniego separatora magnetycznego i zebrać przepływowe komórki zawierające CD66b(-) poprzez przemycie kolumny 15 ml buforu.
   14. Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i natychmiast wypłucz magnetycznie oznaczone ogniwa CD66b(+), mocno wciskając tłok do kolumny.
       nuta: Populacja komórek CD66b (+) składa się głównie z neutrofili, jak określono w analizie FACS, co wskazuje, że >95% frakcji CD66 (+) jest dodatnich dla CD11b, CD15 i CD16, ale ujemnych dla CD14.

Rycina 1: Tworzenie się NET po posiewie LDN otrzewnej. orazPo odwirowaniu w gradicynie gęstości pooperacyjnego płynu z płukania, pokazano komórki odzyskane z warstwy pośredniej. (B) Następnie CD66b(+) LDN oddzielono od komórek jednojądrzastych CD66b(-) i hodowano na 6-dołkowych płytkach pokrytych poli-L-lizyną, a następnie dodano barwnik barwiący jądrowo i natychmiast obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. (C) Ta sama liczba komórek jednojądrzastych CD66b(-) hodowano w tych samych warunkach. (D) Monowarstwę LDN inkubowano z DNazą I przez 5 minut przed barwieniem jądrowym. (E) CD66b(+) LDN hodowano na plastikowych płytkach bez powłoki. Białe słupki reprezentują 100 μm. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do poprzedniej publikacji.