Mikroskopia fluorescencyjna zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych lub NET: technika obserwacji interakcji adhezyjnej między komórkami nowotworowymi a NET

Streszczenie

Źródło: Kanamaru, R. et al. Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje fluorescencyjne barwienie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), zewnątrzkomórkowych składników DNA wydalanych przez neutrofile. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji adhezyjnej między komórkami nowotworowymi a sieciami NET.

Protokół

1. Barwienie komórek nowotworowych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym

1. Przygotuj ludzkie linie komórek rakowych MKN45, NUGC i OCUM-1.
2. Przemyć 1 x 10⁷ komórek PBS + 0,02% EDTA w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodać 1 ml roztworu do barwienia barwnikiem do granulek i delikatnie odpipetować.
4. Rozpuścić 4 μl barwnika Red Fluorescent Cell Linker w 1 ml roztworu do barwienia i wymieszać z zawiesiną komórek z kroku 1.2.
5. Inkubować granulki przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
6. Dodaj 4 ml DMEM (10% FBS), aby zatrzymać reakcję barwienia.
7. Odwirować 270 x g przez 7 minut i odrzucić supernatant.
8. Powtórz kroki 1.6 i 1.7 dwukrotnie.
9. Sprawdź za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (wzbudzenie = 551 nm, emisja = 567 nm), czy komórki nowotworowe są zabarwione na czerwono.

2. Analiza adhezji komórek nowotworowych do NET

1. Hodowla komórek neutrofilowych o niskiej gęstości na 6-dołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną (o średnicy 6 cm) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 ,} co umożliwia wytwarzanie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET
2. Przenieś komórki nowotworowe barwione na czerwono fluorescencyjnie (1 x 10⁶) w 1 ml RPMI 1640 uzupełnionym 0,1% BSA.
3. Dodaj komórki nowotworowe do hodowli LDN, która wytworzyła NET.
4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, co umożliwia komórkom nowotworowym kontakt z NETs.
   nuta: Długa inkubacja indukuje adhezję komórek nowotworowych do LDN lub do płytek.
5. Usuń pożywkę i delikatnie umyj studzienki, dodając 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża (0,1% BSA + RPMI 1640) i obracając naczynie.
6. Powtórz procedurę prania opisaną w kroku 2.5 dwa razy.
   nuta: Ponieważ NET słabo przylegają do płytki, mycie należy wykonywać tak delikatnie, jak to możliwe, aby uniknąć usunięcia samych NET.
7. Dodać zielony barwnik fluorescencyjny do barwienia jądra i chromosomów w końcowym stężeniu 5 μg/ml w celu wizualizacji NET.
8. Obserwuj NET i przyłączone komórki nowotworowe za pomocą odpowiednich filtrów (zielony, wzbudzenie = 504 nm, emisja = 523 nm; czerwony, wzbudzenie = 551 nm, emisja = 567 nm).
9. Scal rysunki, aby pokazać komórki nowotworowe, które są uwięzione przez NETs.
   nuta: W niektórych eksperymentach enzym degradacji DNA dodawano do kultury LDN (końcowe stężenie 100 U/ml) 5 minut przed współinkubacją przez 5 minut.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SYTOX zielony barwnik kwasem nukleinowym 5 mM roztwór w DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał S7020
PKH26 Zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego etykietowania błony komórkowej	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P9691
RPMI1640 Średni	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Czynnik R8758
Albumina bydlęca Liofilizowana w proszku, ≥96% (elektroforeza w żelu agarozowym)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Certyfikat A2153
Płytka MICROPLATE pokryta poli-L-lizyną 6Well	IWAKI, Japonia	Numer katalogowy: 4810-040
Stereoskop fluoresceinowy	BX8000, Keyence, Osaka, Japonia	BZ-X710
Linia komórkowa ludzkiego raka żołądka MKN45	Riken, Tukuba, Japonia	N/a
Linia komórkowa ludzkiego raka żołądka NUGC-4	Riken, Tukuba, Japonia	N/a
Linia komórkowa ludzkiego raka żołądka OCUM-1	Uniwersytet Miejski w Osace, Japonia	N/a	Prezent od dr M. Yashiro
DNaza I	Worthington, Lakewood, New Jersey	LS002138
Roztwór 0,5 mol/l-EDTA (pH 8,0)	Nacalai tesque, Japonia	Numer katalogowy: 06894-14
Dulbecco's Modified Eagle Średnio-wysoki poziom glukozy (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał D5796