Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych lub NET: technika analizy interakcji postadhezyjnej między komórkami rakowymi a NET

Streszczenie

Źródło: Kanamaru, R. et al. Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnowej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie analizujemy zachowanie komórek nowotworowych uwięzionych w zewnątrzkomórkowych pułapkach neutrofili (NET) po adhezji poprzez wspólną hodowlę neutrofili o niskiej gęstości i komórek raka żołądka. Analiza wideo poklatkowego pomaga monitorować różne zdarzenia komórkowe i badać rolę NET w stanach patologicznych.

Protokół

1. Analiza wideo poklatkowego uwięzionych komórek nowotworowych

1. Wyhodować LDN otrzewnowe w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm pokrytym poli-L-lizyną i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Dodać zielony barwnik fluorescencyjny do barwienia jądra i chromosomów, aby uwidocznić NET o końcowym stężeniu 5 μM.
3. Po 1 minucie inkubacji usuń pożywkę i dodaj 2 ml 0,1% BSA + RPMI 1640.
4. Usuń pożywkę i dodaj niebarwione ogniwa 1 x 10⁶ MKN45 zawieszone w 0,1% BSA + RPMI 1640. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usuń wszelkie nieprzyłączone komórki nowotworowe, delikatnie myjąc naczynie, dodając 2 ml podgrzanego podłoża (0,1% BSA + RPMI 1640) i obracając naczynie.
6. Powtórz powyższą procedurę prania dwukrotnie.
   nuta: Ponieważ NET słabo przylegają do płytki, mycie należy wykonywać tak delikatnie, jak to możliwe, aby uniknąć usunięcia samych NET.
7. Dodaj DMEM z 10% FCS uzupełnionym 100 μ / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny.
8. Zamontuj naczynie hodowlane w systemie obserwacji komórek z pełnym widokiem i wybierz odpowiednie pole, w którym komórki nowotworowe są uwięzione przez NET.
9. Kontynuuj kohodowlę przez dodatkowe dwa dni i rób ciągłe zdjęcia pola co 6 minut w normalnym świetle i fluorescencji, która wykrywa odpowiednio komórki MKN45 i NET.
10. Nakładaj obrazy w każdym punkcie czasowym i twórz filmy poklatkowe za pomocą oprogramowania Image Viewer.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SYTOX zielony barwnik kwasem nukleinowym 5mM roztwór w DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał S7020
RPMI1640 Średni	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Czynnik R8758
Dulbecco's Modified Eagle Średnio-wysoki poziom glukozy (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał D5796
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał D8537
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowane, regiony zatwierdzone przez USDA	gibco by life technologies, Meksyk	Numer katalogowy: 10437-028
Albumina bydlęca Liofilizowana w proszku, ≥96% (elektroforeza w żelu agarozowym)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stany Zjednoczone	Certyfikat A2153
Penicylina Streptomycyna	Technologie życiowe Japonia	Rozdział 15140-122
Plazmocyna Profilaktyka	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ANT-MPP
Stereoskop fluoresceinowy	BX8000, Keyence, Osaka, Japonia	BZ-X710
System obserwacji komórek w pełnym widoku	Nikon, Kanagawa, Japonia	BioStudio (BS-M10)
Linia komórkowa ludzkiego raka żołądka MKN45	Riken, Tukuba, Japonia	N/a