Przygotowanie bloku egzosomu: protokół ochrony egzosomów z hodowanych ludzkich komórek raka jelita grubego

Streszczenie

Źródło: Jung, M. K. et al. Przygotowanie próbki i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę przygotowania bloków egzosomów z hodowanych komórek nowotworowych przewodu pokarmowego. Te egzosomy bloki można dalej kroić, barwić i obrazować w celu określenia położenia określonych białek w pęcherzyku dwuwarstwowym lipidów.

Protokół

1. Blokowe przygotowanie egzosomów

1. Osadzać egzosomy z supernatantu hodowli komórek HCT116 przez odwirowanie przy 100 000 x g przez 1,5 godziny. Usunąć supernatant hodowli i ostrożnie utrwalić oczyszczony osad egzosomu 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu (pH 7,0) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Dla 0,1 M kakodylanu sodu, rozpuścić 4,28 g kwasu kakodylowego w 160 ml wody destylowanej (DW). Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 0,1 M HCl, a następnie uzupełnić do 200 ml wodą destylowaną.
2. Usunąć utrwalacz i przepłukać granulki 1 ml 0,1 M buforu kakodylanu sodu w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy, przy czym każda zmiana trwa 10 minut.
3. Po utrwaleniu próbki 1 ml 2% tetratlenku osmu należy utrwalić przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć utrwalacz i płukać trzykrotnie 0,1 M buforem kakodylanu sodu co 10 minut.
5. Inkubować przez 10 minut z sortowaną serią acetonu (odpowiednio 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) na wytrząsarce.
6. Usunąć aceton i inkubować roztwór mieszaniny acetonu o niskiej lepkości w stosunku 3:1 przez 30 minut. Osad egzosomu znajduje się w probówce.
7. Usuń pożywkę i dodaj aceton: pożywkę do osadzania acetonu o niskiej lepkości, a następnie inkubować przez 30 minut.
8. Usuń pożywkę i dodaj pożywkę acetonu 1:3: mieszaninę do zatapiania o niskiej lepkości, a następnie inkubować przez 30 minut.
9. Usuń pożywkę i dodaj 100% mieszaninę do zatapiania o niskiej lepkości i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
10. Zanurzyć próbkę w czystej mieszaninie do zatapiania o niskiej lepkości za pomocą formy do zatapiania i piec przez 24 godziny w temperaturze 65 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aldehyd glutarowy	Ems	Numer katalogowy: 16200
Kakodylan sodu	Ems	Numer katalogowy: 12300
Tetrtlenek osmu 1 g kryształ	Ems	Rok 19100	Stosować tylko w dygestorium
aceton	JUNSEI POWIEDZIAŁ	Numer katalogowy: 1B2031

: