Barwienie immunologiczne odcinków egzosomalnych złotem: technika wizualizacji markerów diagnostycznych w świetle egzosomalnym

Streszczenie

Źródło: Jung, M. K., Mun, J. Y. Przygotowanie próbki i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy immunologiczne barwienie złotem biomarkerów zlokalizowanych w obszarze światła ultracienkich odcinków egzosomalnych. Technika ta umożliwia wczesną diagnostykę chorób poprzez wizualizację docelowych cząsteczek w egzosomach wydzielanych przez chore komórki.

Protokół

1. Barwienie immunologiczne skrawków egzosomu i obrazowanie

1. Przygotuj ultracienkie odcinki bloku egzosomu o długości 60 nm za pomocą ultramikrotomu i zbierz je na siatce niklowej.
2. Inkubować siatki w 50 μl kropli 0,02 M glicyny przez 10 minut, aby stłumić wolne grupy aldehydowe.
3. Płukać w 100 μl DW trzy razy przez 10 minut. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w PBS zawierającym 1% BSA.
4. Inkubować siatki w 50-100 μl kropli przeciwciała anty-KRS (1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA) przez 1 godzinę (W razie potrzeby etap ten należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez noc).
5. Umyj kratki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 μl) PBS zawierającego 0,1% BSA przez 10 minut każda.
6. Przenieść siatki do kropli przeciwciała drugorzędowego przez 1 godzinę (anty-królicza IgG sprzężona z cząstką złota 10 nm (1:100) w PBS zawierającym 0,1% BSA).
7. Umyj kratki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 μl) PBS zawierającymi 0,1% BSA co 10 minut.
8. Podwójne barwienie 2% octanem uranylu przez 20 minut w ciemności i cytrynianem ołowiu Reynoldsa odpowiednio przez 10 minut.
9. Obserwuj siatki pod transmisyjną mikroskopią elektronową przy napięciu 80 kV.
10. Kliknij "Pobierz", a następnie kliknij "Plik" i "Zapisz jako" w systemie kamer CCD pod TEM przy 80 kV. Czas naświetlania był zgodny z ustawieniami automatycznymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Octan uranylu	Ems	Numer katalogowy: 22400	Niebezpieczna substancja chemiczna
Cytrynian ołowiu	Ems	Numer katalogowy: 17900
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	Hitachi	H7600
Siatka miedziana	Ems	G200-Cu
glicyna	Sigma	Numer katalogowy: 022K5404
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	Sigma	Zobacz materiał P4417
Albumina surowicy bydlęcej	Aurion powiedział:	Numer katalogowy: 25557
Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD274 (B7-H1, PD-L1)	Legenda biologiczna	Numer katalogowy: 329710	Cała góra Immumogold
Oczyszczona mysz IgG2b, κ Isotype Ctrl	Legenda biologiczna	401202	Cały wierzchowiec Immumogold (Kontrola)
2. Anty-mysia cząstka złota sprzężona IgG 9-11 nm	Sigma	Zobacz materiał G7652
Paraformaldehyd	Ems	Numer katalogowy: 19210