$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zamrażanie i montowanie mięśni
- Zanurz dolną połowę małej plastikowej zlewki (50 ml) zawierającej izopentan w ciekłym azocie. Izopentan jest gotowy do użycia, gdy staje się lekko lepki i tworzy solidny biały laminat wyściełający wnętrze zlewki (temperatura: -160 °C).
nuta: Zawsze używaj nieiskrzących narzędzi ręcznych z brązu lub aluminium. Unikać wdychania oparów produktu. Stosować przy odpowiedniej wentylacji. Jeśli radzenie sobie z rozlanym płynem i wentylacja jest niemożliwa lub niepraktyczna, załóż odpowiednią maskę oddechową.
- Zamroź trochę medium do zatapiania na uchwycie (korku), zanurzając je na krótko (10 s) w izopentanie.
- Trzymaj mięsień (np. piszczel lub mięsień łydki łydki), trzymając go za ścięgno, pionowo w stosunku do korka, aby utrzymać orientację włókien i umożliwić przekroje poprzeczne.
- Ostrożnie umieść końcową część świeżego mięśnia na zamrożonym podłożu do zatapiania.
nuta: Mięsień będzie się trzymał. Ważne jest, aby NIE otaczać całkowicie mięśnia podłożem osadzającym. Ważne jest również, aby zachować orientację pionową w celu późniejszego określenia pola przekroju.
- Zanurz uchwyt z dołączonym mięśniem w kąpieli izopentanowej (zwykle czas zamrażania to 7-15 s, w zależności od wielkości i składu próbki).
nuta: Zanurzenie w roztworze zamrażającym nie powinno trwać dłużej niż jest to potrzebne do całkowitego zamrożenia próbki. Zbyt długie zamrażanie spowoduje pęknięcie bloku tkankowego, natomiast zbyt krótki czas spowoduje tworzenie się kryształków lodu. Dobrze zamrożony okaz będzie kredowobiały.
- Po zamrożeniu próbki, umieść ją w małej plastikowej torbie lub tubie na próbkę (50 mL) i natychmiast przechowuj w głębokim zamrażarce w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie.
2. Sekcja mięśni
- Ustaw temperaturę roboczą wewnętrznej komory kriostatu na około -23 °C.
- Pozostawić próbkę (uprzednio przechowywaną w temperaturze -80 °C) do aklimatyzacji w temperaturze roboczej (kilka godzin powinno wystarczyć).
- Wyciąć wiele odcinków próbki o grubości 8 μm (najlepiej mięśnie piszczelowe przednie lub brzuchaty łydki) i zebrać je na szkiełkach podstawowych.
nuta: Wytnij sekcję w środkowej części brzucha mięśnia. Ponadto, ze względu na dokładność, przytnij sekcje prostopadle do osi montażowej.
- Szkiełka należy przechowywać w komorze kriostatu. Nie pozwól im się rozmrozić, jeśli celem jest wykonanie badań IF/IHC lub barwienie enzymatyczne.
- Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.