Przygotowanie całego mocowania jelita myszy: Użycie prostego urządzenia do nacinania jelit w celu przygotowania całego wierzchowca

Streszczenie

Źródło: Yoneda, M. et al. Proste urządzenie do szybkiego przygotowania całych wierzchowców jelita myszy. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie pokazujemy przygotowanie całego wierzchowca jelita myszy za pomocą prostego urządzenia do nacinania jelit. Powstałe w ten sposób mocowania charakteryzują się najwyższą i jednolitą jakością i mogą być wykorzystywane do analiz histologicznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Urządzenie

1. Obrobić maszynowo główną część podstawy urządzenia z litego bloku żywicy acetylowej o dużej gęstości, zgodnie z opisem w tym manuskrypcie. Na każdym końcu utwórz paski o wysokości 3 mm i częściowo obrabij z tych rowków 2.5 mm, aby pobrać pręty (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2).
2. Wykonaj pręty ze stali nierdzewnej o średnicy 2,4 mm z zaokrąglonymi końcami.
nuta:Główna rama pokrywy została wykonana z płyty duraluminiowej.

2. Korzystanie z urządzenia

1. Wypreparuj jelito cienkie i okrężnicę z jamy brzusznej za pomocą nożyczek i palców w rękawiczkach. Usuń krezkę, przytrzymując ją zakrzywionymi kleszczami i delikatnie odciągając od jelita.
2. Przepłukać jelita zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, pH 7,4) za pomocą końcówki pipety typu Gilson, która została przycięta na szerszym końcu, tak aby zmieściła się na plastikowej strzykawce o pojemności 10 lub 20 ml typu luer.
3. Ułóż jelito cienkie (SB) na arkuszu ręcznika papierowego i podziel na trzy równe części długości (proksymalny, środkowy i dystalny – SB1, SB2 i SB3) za pomocą nożyczek. Usuń jelito ślepe i ułóż okrężnicę.
4. Wykonaj nożyczkami kilka bardzo małych nacięć w segmentach jelita, aby płyn mógł uciec, a następnie połóż arkusz ręcznika papierowego na jelitach i delikatnie przesuń palcem po preparatach, aby wycisnąć płyn i osuszyć.
5. Podnieś sekcje i włóż pręty ze stali nierdzewnej, które zostały wcześniej zwilżone przez namoczenie w zlewce z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.
   nuta: W razie potrzeby jelito można odwrócić (wywrócić na lewą stronę).
6. Oznacz kawałek kartonu lub bibułę filtracyjną przyciętą na wymiar, aby pasował do podstawy urządzenia. Ołówek jest najlepszy, ponieważ praktycznie wszystkie rozwiązania nie mają na niego wpływu. Sugerowana jest data autopsji, kod eksperymentalny i numer identyfikacyjny zwierzęcia.
7. Umieść kartę lub bibułę filtracyjną w podstawie urządzenia. Włóż pręciki i jelita do szczelin w podstawie urządzenia. Upewnij się, że bliższy koniec segmentów jest umieszczony w ustandaryzowany sposób. Proksymalne końce powinny znajdować się w pobliżu etykiet kart.
8. Umieść górną część urządzenia nad podstawą. Użyj kątowych prętów, aby poprowadzić ostrze skalpela, aby przeciąć sekcje wzdłuż.
   nuta: Pomocne jest, jeśli tkanka jest delikatnie i ostrożnie trzymana palcem, aby upewnić się, że nie porusza się nożem.
9. Zdejmij górną część urządzenia. Ostrożnie usuń bibułę filtracyjną i chusteczki (nadal na prętach).
   nuta: Kawałek sztywnej karty umieszczony pod bibułą filtracyjną pomoże w podnoszeniu.
10. Lekko zwilż (opuszkiem palca w rękawiczce zanurzonym w PBS) segmenty. Zwiń pręt z boku na bok, aby otworzyć jelito i rozprowadzić go płasko. Tkanka będzie wtedy przylegać do bibuły filtracyjnej.
11. Zbadaj wzrokowo preparaty pod kątem wszelkich poważnych zmian.
12. Przenieść tkankę przyklejoną do bibuły filtracyjnej do płytkiej kąpieli (lub pudełka na kanapki) zawierającego utrwalacz.
    nuta: Po przyklejeniu się chusteczki do bibuły filtracyjnej lub karty pozostanie mocno przymocowana. Do konserwacji preparatu można stosować szeroką gamę utrwalaczy. Zaleca się, aby płyn Carnoya był używany do badania proliferacji komórek jelitowych, co jest idealnym utrwaleniem dla najlepszych metod proliferacji komórek; Jednak formalina lub wiele innych utrwalaczy może być również stosowanych, jeśli wymagane są inne punkty końcowe.
13. Po utrwaleniu (zwykle 3 h) należy przenieść preparaty do 70% etanolu. Próbki mogą być następnie przechowywane do czasu, gdy będą potrzebne. Preparaty mogą być badane en face i/lub stosowane do przygotowania próbek histologicznych do H&E lub innych technik barwienia histologicznego, immunohistochemii i/lub hybrydyzacji in situ.
    nuta: Przedłużone utrwalanie może zmniejszyć reaktywność immunohistochemiczną i/lub reaktywność hybrydyzacji in situ. Polipropylenowe pudełka na kanapki idealnie nadają się do przechowywania dużej ilości preparatów.
14. W razie potrzeby utrwalone tkanki z różnych segmentów jelita można przekształcić w "szwajcarskie bułki" i wybarwić za pomocą całego zakresu metod histologicznych, w tym metod opisanych powyżej. Aby zrobić "szwajcarską bułkę", segmenty jelita są usuwane z bibuły filtracyjnej, zwijane wokół patyczka koktajlowego lub wykałaczki, zabezpieczane szpilką entomologiczną i przetwarzane w celu zatopienia w wosku.
15. W razie potrzeby zabarwić masę tkanki błękitem metylenowym, aby uwidocznić nieprawidłowe ogniska krypty.
16. Oceń ustalone przygotowania w czasie wolnym.

Wyniki

Rysunek 1. Zdjęcia oryginalnego urządzenia.Oryginalne urządzenie zostało zbudowane z kilku kawałków metalu, przygotowanych ręcznie. (A) Urządzenie zmontowane. (B) Górna część urządzenia została zdjęta, aby pokazać pręty na swoim miejscu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Delrin	Ryan Plastics, Earls Barton, Wielka Brytania		Wystarczyłby materiał podobny do żywicy acetalowej o dużej gęstości
Płyta duraluminiowa	Metal Supplies Ltd, Park Road, Dukinfield. SK16 5LP Wielka Brytania		Aluminium pochodzi z 1909 roku, dzięki czemu dostępni są alternatywni dostawcy
Gotowe urządzenie (urządzenia) gotowe do użycia	Skontaktuj się z dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk		Skontaktuj się z r.goodlad@imperial.ac.uk, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat dostaw

powiedział: