Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie roztworów
- Jak opisano w Tabeli 1, przygotuj bufor dwukropek, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 100%, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 66%, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 44%, bufor do mineralizacji kolagenazy E i bufor FACS.
- Przygotuj bufor jelita grubego dzień przed zabiegiem i przechowuj go przez noc w temperaturze 4 °C.
- Dzień przed zabiegiem należy przygotować w 100% gęstościowe podłoża do separacji na bazie krzemionki i przechowywać je przez noc w temperaturze 4 °C, umieszczając w temperaturze pokojowej rano w dniu zabiegu do rozmrożenia.
- Przygotuj 66% i 44% pożywki separacyjne na bazie krzemionki rano w dniu izolacji, używając pożywki do separacji o 100% gęstości na bazie krzemionki w temperaturze pokojowej i buforu dwukropek.
- Odmierz odpowiednią ilość kolagenazy E pochodzącej z Clostridium histolyticum i przechowuj w temperaturze -20 °C przez noc przed zabiegiem. Następnego ranka rozpuścić w odpowiedniej objętości Colon Buffer, aby uzyskać Collagenase Digestion Buffer. W przypadku wszystkich inkubacji z buforem do wytrawiania kolagenazy w dniu zabiegu należy wstępnie ogrzać roztwory do temperatury 37 °C.
- Przez wszystkie etapy protokołu utrzymywać jedną wirówkę w temperaturze 20 °C i prędkości obrotowej 859 x g, z wyłączonymi hamulcami (0 opóźnienie) dla wirowania gradientowego. Ustaw kolejną na 4 °C i prędkość obrotową 859 x g, ze standardowym opóźnieniem, dla etapów prania.
2. Zbieranie dwukropka
- Poddać mysz eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie metodę potwierdzającą zatwierdzoną przez AALAC.
- Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i spryskaj futro 70% etanolem. Za pomocą dużych nożyczek do tkanek wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej i odsłoń nienaruszoną otrzewną.
- Za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych otwórz otrzewną. Użyj kleszczy, aby przesunąć jelito cienkie na bok i odsłonić okrężnicę zstępującą. Lekko pociągnij w górę okrężnicę zstępującą, aby maksymalnie odsłonić odbytniczą część okrężnicy. Przetnij dystalną część odbytnicy głęboko w miednicy i wypreparuj i usuń całą okrężnicę jako jedną jednostkę, od dystalnej odbytnicy do czapeczki kątowej.
- Przenieś okrężnicę do 20 ml schłodzonego buforu jelita grubego w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
3. Czyszczenie jelita grubego
- Umieść okrężnicę na zwilżonym ręczniku papierowym i usuń stały stolec, wywierając łagodny nacisk na ścianę jelita końcem nożyczek lub kleszczy.
- Umieścić okrężnicę na szalce Petriego i przepłukać jelito 10 ml schłodzonego buforu jelita grubego za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o pojemności 18 g.
- Przenieś okrężnicę do zwilżonego ręcznika papierowego Colon Buffer i usuń krezkę i tłuszcz ostrym końcem nożyczek.
- Umieść okrężnicę na szalce Petriego wypełnionej 5-10 ml schłodzonego buforu jelita grubego, mieszając ręcznie w celu umycia pozostałej zawartości okrężnicy. Powtórz 2-3 razy.
- Przeciąć okrężnicę wzdłużnie od bardziej muskularnego końca odbytnicy do bliższej okrężnicy (tworząc pojedynczy prostokątny otwarty kawałek okrężnicy) na szalce Petriego wypełnionej świeżym, schłodzonym buforem okrężnicy. Wyrzuć istniejące nośniki i napełnij je czystym, schłodzonym buforem dwukropek.
- Umyj jelito 3 razy, energicznie obracając je na szalce Petriego i wymieniając 5-10 ml schłodzonego buforu jelita grubego po każdym płukaniu.
- Umieść prostokątną tkankę jelita grubego na ręczniku papierowym zwilżonym buforem Colon Buffer i pokrój ją, krojąc poziomo, a następnie na małe fragmenty (odcinki 3 mm x 3 mm).
- Ostrożnie zbierz fragmenty jelita grubego za pomocą drobnych kleszczy do 20 ml schłodzonego buforu jelita grubego w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
- Umyj fragmenty jelita grubego trzy razy, za każdym razem przemyj je w 20 ml buforu okrężnicy, energicznie obracając probówkę przez 30 sekund. Pomiędzy każdym mieszaniem pozwól, aby fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. Dekantacja lub odsysanie próżniowe supernatantu, zapobiegając jednocześnie utracie fragmentów tkanek w procesie aspiracji między każdym myciem.
nuta: Nie ma potrzeby wymiany rurki po każdym praniu.
4. Trawienie kolagenazy 1
- Dodaj 20 ml buforu do wytrawiania kolagenazy do umytych fragmentów jelita grubego w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
- Umieścić zamkniętą probówkę o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C w inkubowanej wytrząsarce orbitalnej z prędkością obrotową ustawioną na 2 x g przez 60 minut. Upewnij się, że fragmenty tkanki są w ciągłym ruchu podczas mieszania; jeśli to konieczne, stopniowo zwiększaj szybkość rotacji, aby upewnić się, że żadne fragmenty tkanki nie osiądą na dnie probówki.
5. Przygotuj gradienty mediów separacyjnych na bazie krzemionki
- Przygotuj 66% i 44% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki, używając 100% pożywek do separacji gęstości na bazie krzemionki w temperaturze 20 °C (temperatura pokojowa) i buforu dwukropek.
- Wlej 5 ml 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki do każdej z 3 oddzielnych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Przygotuj trzy probówki na dwukropek. Tworzy to podstawę procedury izolacji gradientowej o większej gęstości, na którą zostaną nałożone media separacyjne o mniejszej gęstości w celu utworzenia gradientu separacji.
- Przechowywać w temperaturze 20 °C do czasu użycia.
6. Pobieranie supernatantu z trawienia 1
- Zebrać tylko supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i przefiltrować supernatant przez sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej o porach 40 μm, umieszczone w czystej probówce stożkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml, po zakończeniu trawienia kolagenazy 1. Należy uważać, aby nie zassać żadnych istniejących fragmentów tkanki.
UWAGA: Zachowaj wszelkie pozostałe widoczne fragmenty tkanek w probówce. Zostaną one poddane drugiemu trawieniu kolagenazy (krok 8).
7. Bufor trawienia kolagenazy gaszącej
- Napełnij całkowicie probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml schłodzonym buforem Colon Buffer.
nuta: Kolagenaza jest aktywna w temperaturze 37 °C; Stąd schłodzony bufor dezaktywuje ten enzym.
- Odwiruj probówkę w temperaturze 4 °C przy 800 x g przez 5 min.
- Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe. Umyj komórki 25 ml świeżego buforu jelita grubego i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut.
- Zawiesić osad w mniej niż 1 ml świeżego, schłodzonego buforu jelita grubego.
- Umieść stożkową probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml na lodzie.
8. Trawienie kolagenazy 2
- Powtórzyć krok 4 (Trawienie 1) z pozostałymi fragmentami tkanek zachowanymi z kroku 6.1.
9. Dezagregacja tkanek po trawieniu 2
- Energicznie przepłukać fragmenty tkanki tam iz powrotem między probówką a strzykawką o pojemności 10 ml przez igłę o końcu 18G.
- Powtarzaj to spłukiwanie przez co najmniej 7-8 pełnych pasaży, kontynuując, aż nie będą widoczne żadne duże fragmenty tkanek ani zanieczyszczenia.
10. Komórki filtru
- Przepuść zawiesinę dezagregacji tkanek przez sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej o porach 40 μm do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.
- Umyj sitko komórkowe z tkaniny filtracyjnej 10 ml schłodzonym buforem dwukroli, aby odzyskać wszelkie komórki uwięzione w filtrze.
11. Trawienie kolagenazy
- Napełnij 50 ml polipropylenową rurkę stożkową do krawędzi schłodzonym buforem Colon Buffer.
UWAGA: Temperatura buforu jelita grubego ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wygaszenia aktywności kolagenazy.
- Wiruj w temperaturze 4 °C i 800 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe.
- Przemyć przez ponowne zamieszanie w 25 ml świeżego, schłodzonego buforu dwukroli, a następnie odwirować w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe.
- Połączyć zawieszone osady z Trawienia kolagenazy 1 (krok 7) do odpowiedniej probówki z kroku 11.4.
- Powtórzyć krok 11.4 (mycie i odwirowanie).
12. Separacja gęstości na bazie krzemionki Gradientowa separacja mediów
UWAGA: Wykonaj kroki 12-13 tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić szybkie wygaszenie aktywności kolagenazy.
- Postępując zgodnie z krokiem 11.7, ponownie zawieś każdą osadkę w 24 ml łącznie 44% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki na okrężnicę.
- Powoli nałożyć 8 ml pożywki z kroku 12.1 na każdą z trzech probówek przygotowanych w kroku 5.2 (zawierających 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki), używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Utrzymuj stały i powolny przepływ mediów separacyjnych o gęstości 44%, jednocześnie nakładając gradient, aby uniknąć zakłóceń interfejsu.
- Ostrożnie zrównoważyć wszystkie probówki w wiadrach wirówki za pomocą wagi lub wagi.
- Wirować probówki przez 20 minut w temperaturze 859 x g w wirówce bez hamulca w temperaturze 20 °C. Przed wyjęciem probówek należy odczekać, aby wirniki całkowicie się zatrzymały, uważając, aby nie zakłócić pracy komórek na granicy faz gradientu.
13. Zbieranie komórek jednojądrzastych z interfejsu gradientu
- Wizualizuj interfejs gradientu (w pobliżu znaku 5 ml), w którym zwykle występuje biały pasek o grubości 1-2 mm (zawierający MNC).
nuta: Można, ale nie trzeba widzieć białego paska. Jednak MNC będzie na tym interfejsie i powinien zaciemnić przejrzystość interfejsu gradientowego.
- Odessać próżniowo i wyrzucić górne 7 ml górnego gradientu, aby umożliwić łatwiejszy dostęp pipety do interfejsu.
- Używając ciągłego ręcznego ssania i stałego ruchu obrotowego nadgarstka, zbierz warstwę graniczną komórek do czystej stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Zbieraj, aż interfejs między dwoma gradientami będzie czysty i ogniotrwały (wolny od komórek).
- Napełnij probówkę zbiorczą 50 ml schłodzonego buforu FACS. Wirować w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 5 min.
- Zassać supernatant przez aspirację próżniową i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu FACS.
- Policz komórki na hemocytometrze w rozcieńczeniu 1:2 przy użyciu odpowiednich metod wykluczania martwych komórek.
- Przejdź do barwienia FACS lub innych testów ze świeżo wyizolowaną MNC okrężnicy.
Tabela 1: Tabela przygotowania roztworu
| rozwiązanie | formuła |
| Bufor dwukropka | 500 ml RPMI + 10 mM HEPES + 10% FBS (inaktywowane termicznie w temperaturze 56oC przez 60 minut, pH dostosowane do 7,3) |
| Media gradientowe o gęstości na bazie krzemionki 100% (na okrężnicę) | 22,5 ml pożywki o gradiencie gęstości na bazie krzemionki + 2,5 ml 10x PBS. |
| Media gradientowe o gęstości na bazie krzemionki 66% (na okrężnicę) | 10,72 ml Pożywka gradientowa gęstości na bazie krzemionki 100% + 5,28 ml buforu jelita grubego |
| Media gradientowe o gęstości na bazie krzemionki 44% (na okrężnicę) | 11 ml pożywki gradientowej o gęstości na bazie krzemionki 100% + 14 ml buforu jelita grubego |
| Bufor trawienia kolagenazy (na okrężnicę) | 100 j./ml kolagenazy E z Clostridium histolyticum, rozpuszczonej w 40 ml buforu okrężnicy |
| Bufor FACS | 500 ml 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g azydku sodu |
