Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Ustanawianie organoidów 3D dna żołądka pochodzenia ludzkiego
UWAGA: Aby uniknąć skażenia, wykonaj protokół w całości w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej. Ludzką tkankę dna wątroby pobrano od pacjentów poddawanych rękawowej resekcji żołądka.
- Zbierz tkankę od pacjentów poddawanych rękawowej resekcji żołądka i umieść ją w lodowatym roztworze soli fizjologicznej Dulbecco's Phosphate Buffered Salt (DPBS) wolnym od Ca2 + / Mg2 + w dużym plastikowym pojemniku.
- Za pomocą kleszczy energicznie umyj tkankę w sterylnej zlewce zawierającej 100 ml DPBS wolnego od Ca2+/Mg2+. Myć przez około 30 sekund lub do momentu, gdy zanieczyszczenia i krew zostaną usunięte. Następnie za pomocą sterylnej gazy zetrzyj warstwę śluzową z nabłonka.
- Za pomocą dużych kleszczy mocno chwyć warstwę mięśniową tkanki i siłą zeskrob nabłonek za pomocą dużych zakrzywionych kleszczy hemostatycznych. Zbierz zeskrobane fragmenty nabłonka na sterylną, polistyrenową szalkę Petriego.
- Zmiel tkankę nabłonka na fragmenty o wymiarach około 2,0 x 2,0 mm2 za pomocą maszynki do golenia, aby zoptymalizować trawienie tkanek. Przemyć fragmenty tkanek DBPS bez Ca2+/Mg2+ uzupełnionego antybiotykami (DPBS bez Ca2+/Mg2+, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,25 mg/ml amfoterycyny B / 10 mg / ml gentamycyny, 50 mg / ml kanamycyny), aż do momentu, gdy płukanie będzie wolne od krwi. W razie potrzeby wykonaj wiele prań. Wyrzuć pranie, ostrożnie filtrując pranie przez sterylną gazę do zlewki na odpady.
- Zebrać umyte fragmenty do szklanej kolby okrągłodennej o pojemności 125 ml z mieszadłem o średnicy 25 mm i wstępnie podgrzaną pożywką inkubacyjną (pożywka podstawowa uzupełniona 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny, 10 mM buforu HEPES, 1 mg/ml kolagenazy typu 1, albumina surowicy bydlęcej 2 mg/ml klasy hodowli komórkowej). Uszczelnić kolbę okrągłodenną gumowymi przegrodami.
- Włóż igłę rdzeniową 20G do przegrody i podłącz ją do butli tlenu z gumowym wężem. Aby odfiltrować wszelkie zanieczyszczenia, włóż bibułę do rurki, aby utworzyć filtr. Włącz odpływ tlenu na niskim poziomie. Wprowadzić 10–15 igieł odpływowych do przegrody, aby uniknąć pęknięcia przegród.
- Przymocuj zestaw do stojaka pierścieniowego za pomocą zacisków i umieść go w łaźni wodnej skalibrowanej do 37 °C z płytką mieszającą na 30–45 minut. Po 15 minutach inkubacji tkanki należy usunąć 50 μl pożywki inkubacyjnej i sprawdzić wzrokowo, czy nie ma zdysocjowanych gruczołów. Jeśli gruczoły nie są gęste lub nie oddzieliły się od tkanki, pozostaw na dodatkowe 5–10 minut.
- Bezpośrednio po inkubacji dodać 50 ml wstępnie podgrzanego DMEM/F-12 do podłoża inkubacyjnego za pomocą sterylnej pipety serologicznej lub wlewając bezpośrednio do mieszaniny inkubacyjnej.
- Przefiltrować mieszaninę gruczołów przez sterylną gazę do czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Utrzymuj filtrat na lodzie przez 15 minut, aby wyekstrahowane gruczoły mogły osiąść na dnie stożkowej rurki. Uważaj, aby nie przeszkadzać osiadłym gruczołom; usunąć i wyrzucić górne 40 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej. Pozostałe 10 ml zawiesić w 10 ml DPBS uzupełnionego antybiotykami.
- Rozprowadzić mieszaninę równomiernie w probówkach do hodowli komórkowych o pojemności 5 ml. Wirować przez 5 minut przy 65 x g w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
nuta: Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok na lodzie i uniknąć polimeryzacji matrycy błony podstawnej podczas mieszania. Dodatkowo ważne jest, aby wizualnie sprawdzić gęstość dławnicy poprzez pobranie próbek na 50 μl. Optymalna gęstość to ~70% zbiegowiska.
- Następnie umieść gruczoły w 50 μl matrycy błony podstawnej za pomocą pipety z szeroką końcówką. Unikaj wytwarzania pęcherzyków podczas powlekania.
- Aby umożliwić polimeryzację matrycy błony podstawnej, inkubować przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C. W przypadku posiewu na 12-dołkowej płytce hodowlanej dodać 1 ml pożywki hFGO (Advanced Dulbecco's modified Eagle medium/F-12 podłoże uzupełnione 2mM L-glutaminą, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,25 mg/ml amfoterycyny B /10 mg/ml gentamycyny, 50 mg/ml kanamycyny, 10 mM buforu HEPES, 1 mM n-akteylcystyny, 1 x N2, 1 x B27, 50% pożywki kondycjonowanej Wnt, 20% pożywki kondycjonowanej R-spondyną uzupełnionej 100 ng / ml inhibitorem morfogenetycznego białka kości, 1 nM gastryną, 50 ng / ml naskórkowym czynnikiem wzrostu, 200 ng / ml czynnikiem wzrostu fibroblastów 10, 10 mM nikotynamidu i 10 μM inhibitora Y-27632 ROCK) na studzienkę. Jeśli nie używasz 12-dołkowej płytki hodowlanej, dodaj wystarczającą ilość pożywki, aby zanurzyć pęcherzyk macierzy błony podstawnej.
- Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z wilgotnością 5% CO2 . Zmieniaj nośniki co 4-5 dni.
