$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
- Autoklaw jeden zestaw nożyczek jelitowych, zwykłych nożyczek i kleszczy w sterylnym pojemniku.
- Umieścić 96-dołkowe (z płaskim dnem) naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Przygotować 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej z odczynnikami wymienionymi w tabeli materiałów.
- Inkubować kompletną pożywkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
- Rozmrozić odtworzoną błonę podstawną, umieszczając ją w pojemniku na lód. Odtworzona błona podstawna stanie się płynna w temperaturze 4 °C.
- Napełnić cztery szalki Petriego zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS (4 °C).
2. Izolacja krypt jelita cienkiego
- Ofiarowanie przez wdychanie CO2 myszy Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 na tle C57BL6/J. Wytnij otrzewną wzdłużnie za pomocą nożyczek.
- Przytrzymaj brzuch kleszczami i przetnij go poprzecznie na pół.
- Za pomocą nożyczek jelitowych od teraz wyciągnij jelito i umieść je na szalce Petriego zawierającej PBS.
nuta: Nożyczki jelitowe mają ostrą i końcówkę. końcówka tych nożyczek ma za zadanie nie uszkodzić architektury krypty-kosmków podczas otwierania jelita.
- Zacznij od umieszczenia końcówki w żołądku i delikatnie przepchnij ją przez odźwiernik. Kontynuuj, tnąc nożyczkami i ciągnąc kleszczami.
- Gdy całe jelito cienkie zostanie otwarte wzdłużnie, umyj je w zimnym PBS, trzymając je kleszczami i delikatnie spłucz w roztworze PBS ruchami w kształcie litery U.
- Gdy wszystkie resztki stolca zostaną usunięte, przystąp do spłaszczania jelita na desce do krojenia, świetlistą stroną do góry. Strona luminalna jest łatwo rozpoznawalna po braku naczyń krwionośnych i bladym wyglądzie w porównaniu z częścią zewnętrzną.
- Za pomocą szkiełka delikatnie usuń kosmki, zeskrobując spłaszczone jelito. Wykonaj ten krok dwukrotnie na całej długości tkanki.
- Przeciąć jelito cienkie sterylnym ostrzem chirurgicznym na 2–5 mm kawałki.
- Umieść fragmenty jelita cienkiego w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego PBS.
- Oczyść fragmenty tkanki, usuwając wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, pipetując je w górę i w dół w PBS. Odrzucić supernatant i powtarzać ten krok, aż PBS będzie całkowicie czysty.
- Dodaj 15 ml zimnego PBS, aby całkowita końcowa objętość PBS wynosiła 25 ml. Dodać 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i inkubować przez 45 minut na walce w temperaturze 4 °C.
- Wyrzuć PBS/EDTA.
- Dodać 10 ml PBS i odłączyć krypty, ostro pipetując fragmenty tkanek w górę iw dół (co najmniej trzy razy). Zebrać supernatant.
- Powtórz krok 2.13 cztery razy. Dodaj pożywkę hodowlaną, aby osiągnąć końcową objętość 50 ml.
- Granulować komórki przez odwirowanie (300 x g przez 5 min).
- Zawiesić osad w 10 ml pożywki hodowlanej i osadzać krypty przez odwirowanie (80 x g przez 3 min).